中国工程院食品安全院士团队

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产品名称：大肠埃希氏菌志贺毒素核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
英文名称：Multiplex PCR Detection Kit for Shiga toxin-producing E.coli (Fluorescent Probe Assays)

产品编号与包装规格：

产品简介：本试剂盒仅适用于食品中致病性大肠埃希氏菌（STEC）产志贺毒素类型的定性检测。

检测原理：基于Real Time PCR技术，利用针对肠杆菌科的16S rRNA基因和STEC的志贺毒素基因stx1、stx2的引物组、荧光探针以及其他反应优化配置所需试剂，加入待检样品核酸即可进行扩增反应。在扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被Taq酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定致病性大肠埃希氏菌（STEC）产志贺毒素的类型。
stx1、stx2、16S rRNA基因分别对应荧光报告基团HEX、FAM、Cy5。

大肠埃希氏菌志贺毒素核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)产品组分：

储存条件与保质期：-20℃储存，有效期为12个月，避免反复冻融。

灵敏度：最低检验限达到 100 CFU/Test

所需其他材料和适用仪器：荧光定量PCR仪（具有能够检测HEX、FAM、Cy5标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。

大肠埃希氏菌志贺毒素核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)使用指南：

1，样品前处理

     1) 参照 GB 4789.6−2016，使用 1 μL 接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养 18 h~24 h 的待鉴定的可疑菌落，悬浮到含 30 μL 裂解液的无菌离心管中，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热 10 min；
     2) 12000 r/min 离心 15 min，上清即为粗提的DNA，可转移至 0.2 mL 无菌离心管中，在-20℃下可长期保存。也可以选择商业化的细菌基因组提取试剂盒进行提取；

2, 加样、反应

   1) 按照需求取n个PCR反应管（n=1管阴性对照+待检测样品数+1管阳性对照），从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，以上每管加入20 μL预混液，待用。
   2) 向上述n个反应管中分别加入阴性对照、待测样品DNA、阳性对照各5 μL，总反应体积为25 μL。盖紧管盖，短暂离心，立即进行PCR扩增反应。
   3) PCR反应体系为25 μL，取HEX、FAM、Cy5检测通道，在反应阶段2中60℃时收集荧光信号，具体程序如下：

3, 结果：一般情况下，可通过软件自动设定的基线、阈值等直接读取检测结果。如需调整，可根据所使用仪器的自身情况（如噪声等）以及选取的不同荧光通道进行调整。

   1) 质量控制：阴性对照未出现明显的S型扩增曲线或Ct值＞37，阳性对照出现S型扩增曲线且其Ct值＜30。若阴阳性对照不同时满足上述条件，则本次检测结果无效，应重新检测或与产品技术支持联系。

   2) 结果判读：（根据反应所得Ct值判读，具体见下表：）

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• FZ017BF2 大肠埃希氏菌志贺毒素核酸检测试剂盒 产品使用说明书