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几种细胞增殖与毒性检测方法

01 MTT法

MTT：一种黄色染料，化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理 为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan )并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚矾（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

优点：灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

02 XTT法

XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS )联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。

优点：
1. 使用方便，省去了洗涤细胞；
2. 检测快速；
3. 灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；
4. 重复性优于MTT。
缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

03 WST-1法

WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成水溶性橙黄色的甲臜产物( Formazan )。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。WST-1是MTT的一种升级替代产品。

优点：
1. 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
2. 比XTT和MTT更加稳定，使实验结果更加稳定；
3. 与MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

04 CCK-8法

CCK- 8全称为Cell Counting Kit-8，试剂中含有WST-8；化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯( 1-Methoxy PMS )的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物( Formazan )。生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

优点：
1. 使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
2. 检测快速；
3. 灵敏度高，优于WST-1；
4. 重复性优于MTT；
5. 对细胞毒性小；
6. 试剂稳定性很好，优于WST-1；
7. 为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

缺点：
1. 与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵；
2. CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

表1：几种细胞增殖/毒性检测方法的比较

普遍认为，CCK-8是操作更简单、数据更稳定、灵敏度也较高的细胞增殖与毒性检测方法。CCK-8实验过程简单总结为配置细胞悬液、加入待测物质、待测物质与细胞共同孵育一定时间、加入CCK-8、测定吸光度五步。但其中仍有需要注意的地方，值得探讨学习。

来源：“金沙生物”公众号
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