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细胞状态不好原因

细胞间的小伙伴们肯定遇到过细胞状态很差，常常出现的现象是：细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多（细胞凋亡后的细胞碎片）、单个细胞内有空泡（凋亡）且空泡比较多；如果细胞出现老化，也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多，此时观察到的细胞状态也是不正常的。因此细胞状态差只是对这些现象的一种笼统说法。究其根本，细胞状态变差主要是由于几种原因：
● 细胞营养条件不够或不适应
● 细胞污染
● 细胞老化
● 细胞复苏问题

细胞状态不好原因分析

小编帮您深入分析影响细胞状态的这些原因。

一、细胞营养条件不够或不适应

细胞营养条件不够时，就需要从培养基方面考虑。

1. 胎牛血清
由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中最-普遍的试剂的基础。当实验需要更换血清时，细胞需要有一段适应期。因此，要根据自己的细胞种类进行合适的选择。

2. 基础培养基
培养细胞时，除了血清还需要添加基础培养基，混合成为完全培养基，基础培养基是成分确定且知其确切含量的，可以补充血清中缺乏的营养元素，基础培养基一般含有氨基酸、无机盐、维生素、含碳物质，蛋白和其他营养元素，每种成分对于细胞存活、代谢等功能都有不同影响，不同细胞系需要的成分含量也不同，因此市面上会存在各类培养基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基础培养基也需要根据自己培养的细胞种类进行更合适的选择。
自行配制基础培养基时，需要注意是否需另外添加营养物或必需物至培养基中（如：碳酸氢钠）并调整pH值。使用不适合的培养基培养细胞，细胞仍可生长但特性会改变。培养基中常用的酚红（pH指示剂）本身有微弱雌激素作用，会刺激具有雌激素受器的细胞生长。针对上述原因细胞不适应我们建议以下解决方法：最好使用最适宜的培养基，如果条件不允许，可以换液时不要全量换液逐渐增加新的培养基比例，1/4、1/2、3/4到1，多传代几次，让细胞慢慢适应。另外，细胞培养箱的温度、CO2、细胞的生存环境要适宜，一般来说最佳温度：是37 ℃， CO2：浓度为5% ， pH：为7.2-7.4，还有渗透压等，大家要注意调好，不要随意改变。

二、细胞被污染了

污染情况通常从以下几部分考虑。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、细菌、支原体、黑胶虫、病毒、细胞交叉污染等。

1. 真菌污染
这类微生物外观类似棉絮状的漂浮物，在显微镜下可观察到菌丝体，污染早期不会使培养基变黄。

2. 酵母菌污染
显微镜下常见成串的珠状物形态呈卵形，大约比细胞小5~10倍，当其进行出芽生-殖时，会聚集成连体结构；爆发污染严重时，会造成培养基pH值改变，不易除去。

3. 细菌污染
培养基在短时间内变成黄色或白色浑浊，细胞停止生长甚至死亡；有些状况下培养基颜色改变不明显但细胞形态会变异（出现多角，多核状况）、细胞不附着，显微镜观察背景有大量黑点。

4. 支原体污染
支原体种类较多，常以寄生或腐生营养方式生长，广泛存在于环境之中，是细胞培养过程常见污染，经常来源于实验人员（支原体常见于人体皮肤、呼吸道、生-殖道和消化道）、动物源血清及胰酶、消毒不完全的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通过一般标准的细胞培养过滤方法，0.22μm过滤膜。支原体增长速度相较于细菌比较缓慢，污染初期（轻微）培养基可能依然清澈不会变黄，所以轻微污染时不容易用常规方法发现（细胞外观观察或是DNA染色法）确认。支原体污染不但会缓慢改变细胞形态、增殖、基因表达、蛋白合成及代谢反应，它携带的DNA/RNA与蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌体实验结果偏差。

5. 黑胶虫污染
目前科学界对黑胶虫并无定论，认为是不明沉淀现象或多种未知生物污染现象的通称。在高倍率显微镜头下，可观察到各式形状的小黑点（卵圆状、球状、杆状等）、活跃的布朗运动及明显游动现象，部分黑胶虫具有细胞毒性，可引起细胞生长迟缓或裂解凋亡。

6. 病毒污染
病毒感染可能来自宿主动物细胞或病人，病毒感染及传播具有细胞专一性，在细胞培养污染物中是相对较难检测的。然而一旦细胞遭受污染后显微镜下能明显观察到细胞碎片增多、肿大、圆缩、脱落等病态变形，严重时会在单层细胞上观察到局部破损空斑。

7. 细胞交叉污染
曾有文献报道统计，目前使用的细胞株大约有15~20%不是科学家们所认为的细胞，而在生物医药领域中，细胞来源和细胞株身份鉴定检测观念普遍缺乏。细胞株的交叉污染，常在不经意的实验疏失（不同细胞株分盘时，共享一瓶培养基、枪头、移液管忘记更换，而造成不同细胞株之间的混合污染，或是实验操作人员录入错误细胞株名称，继代时的培养皿，冷冻细胞时的冻存管）中发生，而造成错误后续数据搜集；目前常用的细胞身份验证的方式包括：短串联重复序列（STR）、同功酶分析、染色体组分型、扩增片段长度多态性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前国际细胞库（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于细胞株身份鉴定方法。

三、细胞老化了

无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。老化细胞不会立即死亡，但其基因表达会发生变化。

解决办法：没有可逆的办法，只能及时更换新的细胞。

四、细胞复苏问题

细胞复苏主要考虑冻存的问题，因为复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板，下面这些原因需要逐个排查：
1、冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，因为这个问题就两种肺癌细胞和一种肝癌细胞实验室做过试验，这个应该是绝大部分人细胞复不活的一个原因。太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。
2、冻存液好不好，甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。
3、冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。
4、在冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。
5、冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。
6、如果细胞污染，是否能很快看到。从这个角度讲建议去除离心这步。
7、细胞在冻存前是否过密。

来源：“硕博医学实验”公众号
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