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在大肠杆菌感受态细胞的制备实验中，通过特殊方法（如电击法或CaCl2法）处理细胞，使得细胞膜的通透性暂时性地发生改变，从而形成能够允许外源DNA分子进入的细胞，这些被称为感受态细胞（Component cells）。

大肠杆菌蛋白表达系统被广泛应用，是经济实惠的蛋白表达系统之一。该系统具有清晰的遗传背景、快速的细胞增殖、高表达量、良好的稳定性以及强大的抗污染能力等特点，因此适用于多种蛋白的表达。

CaCl2法制备感受态细胞（图源网络）

1.实验材料、试剂

E. coli DH5α菌株、LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB。

2.仪器耗材

培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管。

1. 细胞的生长状态和密度

从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×10⁷个左右为佳。对于TG1菌株，当OD600为0.5时，细胞密度在5×10⁷个/ml左右。受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积10%-15%的无菌甘油或-70℃保存。

2. 质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应为超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比。加入的外源DNA量过多或体积过大会使转化率下降。DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。质粒分子量过大的转化效率低，大于30kb的重组质粒难以进行转化。重组DNA分子的构型与转化效率密切相关，环状重组质粒的转化率较线性重组质粒高10~100倍。

3. 试剂的质量

所用的CaCl2等试剂应是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

4. 防止杂菌和杂DNA的污染

操作过程应在无菌条件下进行，使用新的离心管、移液枪头，并经高压灭菌处理。所有试剂都要灭菌，并注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则会影响转化效率或杂DNA的转入。

5. 操作需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

1. 为确保高效转化，细胞活力应保持在每毫升10^8个细胞以下，对于大多数散大肠杆菌而言，相应的光学密度（OD值）约为0.4左右。为避免细菌培养物的生长密度过高，建议每15-20分钟测定一次OD600值以进行监测。通过记录监测时间和OD值，可制作一个图表来预测培养物达到OD600值0.4所需的时间。当OD600值达到0.35时，即可收获细菌培养物。

2. 不同生长阶段的菌株间，OD值与每毫升中活细胞数量存在显著变化。为了标准化，需测量特定大肠杆菌菌株在其生长周期中不同时间点的OD600值，并将每个稀释度的培养物均匀涂布在不含抗生素的LB琼脂板上，以计算每个时期的活细胞数量，以确保分光光度计的读数标准化。

3. 大多数大肠杆菌（除了MC106）在转化中使用TFB替代CaCl2可以获得相同或更好的结果。根据1979年Dagert和Ehrlieh的实验，细胞在4℃条件下可在CaCl2溶液中保存24-48小时。在最初12-24小时的储存过程中，转化率增加了4-6倍，然后逐渐降低至初始水平。

4. 选择新鲜平板的单克隆以确保克隆的新鲜程度，即刚涂布生长过夜的平板。

5. 菌体的OD600值对转化效率有影响，JM109或BL21的OD值为0.35，DH5α为0.4，应尽量避免过高的OD值，不得超过0.6。

6. 在低温处理后，应在冰上保存12-24小时后分装，并冷冻保存于-80℃。

7. 所有用品（如离心管、药瓶等）应使用新的，若使用旧的，则必须确保其干净，并准备好CaCl2溶液。