中国工程院食品安全院士团队

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淋球菌耐药性是被WHO和CDC认定的高危级抗菌素耐药性（AMR）威胁。从2006年至今，淋球菌耐药性迫使临床治疗方案逐渐失效，从最初的5种治疗方案缩减到仅限头孢曲松和阿奇霉素，而淋球菌对头孢曲松和阿奇霉素的耐药性也在出现。这样的威胁强调了对淋球菌耐药性及时和准确地监测的必要性。相较于耗时费力的金标准AST技术，NAAT技术能够高特异且快速地检测耐药淋球菌，其应用也在不断更新发展，但因其根本上不具备提供耐药表型的能力，反而限制了临床实验室淋球菌培养和表型AST技术的发展，进一步加剧了挑战。为促进针对淋球菌的快速有效的AMR监测，并适应当前临床诊断转向NAAT的应用大趋势，基于基因层面的表型分析技术成为了当前的一大研究热点。基于此，Tza-Huei Wang团队提出了一种直接qPCR方法，应用于淋球菌的病原鉴定和药敏分析。该研究的创新点可归结为2点：（1）规避了核酸技术中常见的额外的DNA提取步骤，简化了操作流程；（2）引入了一种无蛋白培养基：GW，能够支持低接种量的淋球菌的生长。

简单说来，直接qPCR的工作原理可以概括为：淋球菌在不同生长环境（抗生素存在与否；抗生素暴露的剂量）的存活状态表现不一，而这种差异可以通过qPCR的Cq值体现出来，由此完成病原鉴定和药敏测试（图1）。qPCR靶向淋球菌的opa基因，通过引入高抗抑制剂聚合酶，避免了额外的核酸提取和纯化步骤，可直接在添加有抗生素的GW培养基（10 μL）中进行qPCR扩增。基于qPCR的药敏分析是通过比较细菌的生长实现的，因而，作者首先评价了直接qPCR测定淋球菌在GW培养基中的生长情况。在这里，Cq是一个以2为基的对数量，细菌密度每增加一倍，Cq值会对应下降。因而，基线Cq减去测试组Cq获得的负值（−ΔCq）可以用来量化在对数尺度上的细菌密度的倍数变化。使用这种表示法，可以通过−ΔCq—培养时间图的斜率来计算倍增时间。在本研究中使用的淋球菌菌株中，−ΔCq随着培养时间的变化近似呈线性增长，倍增时间约为1小时，表明淋球菌在GW培养基中呈指数生长。然后，作者向GW培养基中加入环丙沙星（0.06 μg/mL或0）对淋球菌进行孵育，以此初步判断方法的可行性。结果显示，基于直接qPCR的药敏分析仅需抗生素孵育1 h即可实现。相较之下，基于OD值的宏观药敏分析则需至少9 h的抗生素-细菌共孵育时间（图2）。另外，从图中也可看到，直接qPCR方法具有更高的动态范围和更小的偏差。随后，作者进一步引入3种常用的抗生素：青霉素、四环素和环丙沙星，并在共孵育4 h后评估淋球菌的生长情况。在此，作者引入了一个剂量-反应生长模型，内含2个关键参数，一个是2^−ΔCq（细菌定量），一个是细菌活力（0-100），以此来展现抗菌药物浓度和细胞活力之间的关系。该模型能够估计细胞活力为最大值的80%（EC₈₀）时的抗生素浓度，以此预测给定抗菌药物的耐药性水平，以这种方式导出的EC₈₀值与CLSI质量控制范围完全一致（图3）。进一步，作者利用2株标准菌株（ATCC 49226和ATCC 43069）和5株临床分离株及3种抗生素：青霉素、四环素和环丙沙星评价了方法的药敏分析能力。同样的，EC₈₀值仍然作为药敏判定标准，基于此获得的耐药/中介/敏感信息与传统培养技术方法（MIC值）获得的结果基本一致，基本一致率为85.7%，分类一致率为94.5%，由此显示了本方法为淋球菌耐药性提供准确和客观的临床解释的潜力（图4）。

总的来说，本研究发展的表型-基因型AST技术突破了传统药敏技术的耗时长以及NAAT技术的结果代表性欠缺的两大弊端，在淋球菌感染的鉴定及药敏分析上具有较强的应用潜力。不过，研究始终围绕在3种抗菌素，且临床样本量不足，研究结果代表性仍然欠缺，尚需大量实验验证。

图1 淋球菌鉴定和AST的直接qPCR检测流程。将淋球菌接种于GW培养基中，并向其加入不同剂量的抗生素，孵育1-4小时后，从中取样进行直接qPCR检测，以此获得感染病原信息和药敏信息。另外，在此可通过内置的熔融曲线分析来验证扩增子的特异性。图中ΔCq为测试组与对照组之间的Cq差值。

图2 通过直接qpcr和OD检测ATCC 49226的生长情况。将10⁵个淋球菌接种于10 mL的GW培养基中，含（黑点）和无（红点）0.06 μL/mL环丙沙星。每小时取一次样品（300 μL）进行试验。所有测量的Cq值减去0 h测定的Cq值以进行归一化。（A）直接qPCR方法具有较宽的定量范围，可以区分药物处理和未处理细胞在培养1 h后的生长。（B）基于OD的定量能力相对较有限，动态范围较窄。它可以区分药物处理细胞和未处理细胞在9 h培养后的生长。

图3 基于直接qPCR的剂量-反应模型。图中显示了淋球菌在环丙沙星、青霉素和四环素处理下的剂量-反应模型，最大生长活力的80%对应的抗生素浓度为最低抑菌浓度（EC₈₀），与CLSI方法获得的值基本一致。

图4 基于直接qPCR的检测结果与金标准MIC值的比较。

原文DOI: 10.1021/acsinfecdis.8b00104

来源：微生物安全与健康网，作者~邹晶晶