一种用于同时检测单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌活菌的qPCR技术
发布时间：2024-09-14 浏览次数：124
单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌是奶制品中引起食源性疾病的常见病原体。快速和准确的检测对于有效控制其感染至关重要。然而沙门氏菌等传统检测靶标在特异性和敏感性方面存在不足，可能导致假阳性或假阴性结果。qPCR技术无法区分来自非活细胞和活细胞的DNA扩增，因此可能因非活细胞或受损细胞中的DNA泄漏而导致假阳性结果。尽管PMA可以选择性地与非活细胞的DNA结合并抑制其扩增，但Rey等人的研究表明，单独的PMA处理可能无法完全抑制非活细胞的DNA扩增，特别是在细胞碎片存在的情况下。
作者在研究中采用了多种方法来提高同时检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌活菌的效率和准确性。作者制备了直径为20纳米的金纳米颗粒（AuNPs），并评估了其对qPCR系统荧光信号的增强效果。将AuNPs应用于双重qPCR系统，发现其能够显著提高系统的荧光信号强度，进而提高了检测的灵敏度。其次使用生物信息学方法筛选针对L. monocytogenes（AX10_RS05385）和Salmonella（SEEP-A511_RS03120）的高度特异性引物，将筛选出的特异性引物组合，构建一个能够同时检测L. monocytogenes和Salmonella的双重qPCR系统。探索双重qPCR中的最佳引物对比例（3:1），以平衡两个扩增反应。之后引入丙酸丙酯（PMA）作为活细胞DNA选择性染料，以区分活细胞和非活细胞的DNA。探索并确定了最佳的PMA处理条件，包括PMA浓度（20μM）、孵育时间（8分钟）和曝光时间（5分钟），以最大程度地抑制非活细胞的DNA扩增。在PMA处理前，使用0.01%的十二烷基硫酸钠（SD）进一步增强对非活细胞DNA扩增的抑制效果，使检测更加准确。利用金纳米颗粒（AuNPs）增强qPCR的检测信号，从而提高检测系统的灵敏度。
作者又对DNA提取、qPCR反应条件进行了优化。采用热裂解法代替传统DNA提取试剂盒进行DNA提取，该方法仅需15分钟，且更适合现场检测。使用两步扩增法优化qPCR反应条件，两个步骤同时在60℃进行，以减少循环中温度升降过程所需的时间。通过这些方法和策略，作者成功地开发出了一种灵敏度高、特异性好、检测时间短的双重qPCR系统，该系统能够同时检测牛奶中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。这不仅提高了检测的准确性和效率，还为食品安全检测提供了一种有力的工具。
在人工污染的牛奶中进行AuNPs-SD-PMA-qPCR检测，验证该方法的准确性、灵敏度和特异性。比较不同方法（如qPCR、PMA-qPCR和AuNPs-SD-PMA-qPCR）在检测活菌和非活菌方面的差异。并且通过对一系列不同浓度的活菌样品进行检测，评估了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法的灵敏度。实验结果表明，该方法能够准确检测到低至5×10¹CFU/g的活菌。通过与常见食品致病菌如大肠杆菌（E. coli）和柠檬酸杆菌（Citrobacter spp.）等进行交叉检测，验证了该方法的特异性。通过标准培养方法对检测结果进行验证，确认了AuNPs-SD-PMA-qPCR方法在实际样品检测中的准确性和可靠性。
综上所述，作者通过一系列精心设计的实验，成功地开发并优化了一种快速、高特异性和高敏感性的方法，用于同时检测牛奶产品中的L. monocytogenes和Salmonella活菌。
图1所示。(A)引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120 qPCR扩增曲线。(B) qPCR检测引物AX10_RS05385和SEEPA511_RS03120的熔化曲线。(C) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物比例的扩增曲线。(D) AX10_RS05385:SEEPA511_RS03120不同引物配比的熔化曲线。
图2所示。PMA处理的优化。不同浓度PMA对L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影响;不同孵育时间对L. monocytogenes (C)和Salmonella (D) 的影响;不同暴露时间对L. monocytogenes(E)和 Salmonella (F)的影响。不同的小写字母表示非活细胞组间扩增结果(Ct值)有显著差异(p < 0.05)，不同的大写字母表示活细胞组间扩增结果(Ct值)有显著差异(p < 0.05)。
图3所示。不同SD浓度对L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的影响。(C) AuNPs、AgNPs、PEI@Fe3O4和银纳米线对SD- pma - qpcr系统ΔRn值的影响。(D) AuNPs- SD-PMA-qPCR和SD-PMA-qPCR的扩增曲线。不同小写字母表示不同非活细胞组间扩增结果(Ct值)差异显著(p < 0.05)，不同大写字母表示不同活细胞组间扩增结果(Ct值)差异显著(p < 0.05)。
图4所示。应用AuNPs-SD-PMA-qPCR、PMA-qPCR和qPCR技术鉴别L. monocytogenes(A)和Salmonella (B)的活/非活细胞。(C) AuNPs-SD-PMA-qPCR检测的特异性。(D-E)不同梯度稀释L. monocytogenes和Salmonella的扩增曲线。(F)不同梯度稀释的L. monocytogenes和Salmonella的熔化曲线。不同小写字母表示不同检测方法扩增结果(Ct值)差异有统计学意义(p < 0.05)。
DOI: 10.1016/j.foodcont.2024.110711
来源：微生物安全与健康网，作者~魏文杰。
