中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

食品中霉菌毒素的污染是一个严重的全球性问题。其中,赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)是最毒性最高、分布最广的真菌毒素之一。OTA在人畜中可引起各种不良健康影响,并对全球经济和国际贸易造成损害。因此,通过有效的检测方法监测食品和原料中OTA的含量对于确保食品安全至关重要。

目前用于OTA检测的传统方法，如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)等,存在仪器昂贵、样品前处理复杂、检测过程时间长以及受基质干扰等缺点。免疫分析法作为一种快速检测OTA的有力工具,由于其灵敏度高、操作简便等优点而备受关注。但传统免疫分析法依赖于人工合成的毒素类似物作为竞争性抗原,存在合成路径复杂、批次误差大以及环境污染等问题。近年来，许多研究报道了利用模拟肽和抗独特型抗体等替代品来取代人工合成的抗原用于免疫分析，但大多数仍与单克隆抗体结合。

本研究以OTA特异性单域抗体Nb28和其特异性结合的模拟肽Y4为基础,设计了一种基于比色学比率的生物发光免疫传感器(RBL-免疫传感器),用于快速、便携、灵敏的OTA检测。该传感器由三个组分组成:Nb28-大片段纳米发光素(NLg)、多价Y4-小片段纳米发光素(MPSm)和绿色增强纳米光子(GeNL)。NLg与MPSm的特异性结合会引起纳米发光素的重组,产生蓝光发射;而GeNL能通过生物发光共振能量转移(BRET)产生绿光发射。OTA的浓度变化可通过微孔板读数机测量的发射峰强度比(λ₄₅₈/λ₅₁₈)以及智能手机拍摄的图像的蓝/绿通道比值进行定量检测。与单一信号的传感器相比,该RBL-免疫传感器显示出更稳定的检测性能,不受外部因素的影响。

结果与讨论

1 标记蛋白的表达与纯化

将编码MPSm和GeNL的重组表达载体pET25b-MPSm和pET25b-GeNL转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经诱导表达并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化得到目标蛋白。SDS-PAGE分析结果显示,经纯化的NLg、MPSm和GeNL在还原条件下均呈现单一条带,分子量分别约为35.5 kDa、11.8 kDa和47.7 kDa,与预期一致。其中,MPSm作为一种七聚体结构的融合蛋白,在非还原条件下呈现约82.6 kDa的条带。

2. 传感器的工作机理验证

进一步验证了MPSm作为Nb28的识别元件,以及NLg-MPSm结合是否能够诱导纳米发光素的重组并产生发光信号。结果表明,在没有OTA存在时,"NLg+MPSm"传感器可产生约460 nm的明显发光峰;而加入100 ng/mL OTA后,峰值信号消失,证实了MPSm与NLg之间的特异性竞争性结合。此外,引入校准酶GeNL作为内参后,"NLg+MPSm+GeNL"传感器在无OTA存在时可同时观察到约460 nm和520 nm的两个明显发光峰;而加入100 ng/mL OTA后,460 nm处的发光峰显著降低。这进一步验证了上述设计推测的反应过程。

通过SPR动力学测试,NLg和MPSm的平衡解离常数KD为1.25 μM,远高于Lg和Sm的内在亲和力(KD=190 μM),表明二者之间具有更强的相互作用。与单一发光信号的传感器相比,引入GeNL后的RBL-免疫传感器在持续时间内保持了稳定的发光信号比值,不受基质消耗的影响。这归因于纳米发光素和校准酶GeNL同时催化底物而产生的双信号变化是同步的,因此信号比值变化更加稳定持久。

3. RBL-免疫传感器的优化

为获得RBL-免疫传感器对OTA的最佳检测性能,优化了NLg、MPSm和GeNL的浓度等关键参数。首先通过发光成像技术,确定了NLg和MPSm的最佳浓度比,以实现免疫传感器的可视化检测。在此基础上,进一步采用校正曲线法优化了GeNL的浓度。结果显示,当NLg、MPSm和GeNL的质量浓度分别为0.5 μM、0.25 μM和0.125 μM时,免疫传感器表现出最佳的发光信号和检测灵敏度。

4. RBL-免疫传感器的性能评估

在优化的实验条件下,利用微孔板读数机和智能手机分别对免疫传感器的检测性能进行了评估。微孔板读数机测定结果显示,传感器的检测限(LOD)为0.98 ng/mL,动态检测范围为1.56-1000 ng/mL;而基于智能手机图像分析的检测限为1.89 ng/mL,动态范围为3.13-1000 ng/mL。两种检测方式下的标准曲线拟合良好,表明该免疫传感器具有优异的检测性能。

为评价传感器的选择性,除OTA外还考察了6种其他常见真菌毒素(OTB、OTC、AFB1、DON、ZEN和FB1)对其的交叉反应性。结果表明,所有其他毒素的半数抑制浓度(IC50)远高于OTA,表明该传感器具有良好的选择性。此外,通过回收实验验证了传感器在黑胡椒和白胡椒样品中的准确性,回收率在85.2%-115.3%之间,满足相关标准要求。

最后,该RBL-免疫传感器还成功应用于10种商品胡椒粉样品中OTA含量的检测,并与HPLC分析结果进行了对比验证。两种方法测定结果吻合良好,进一步证实了该传感器作为一种快速、灵敏、可靠的OTA检测工具的潜力。

结论：本研究以OTA特异性单域抗体Nb28和其结合的模拟肽Y4为基础,设计并开发了一种基于比色学比率的生物发光免疫传感器,实现了OTA的快速、便携和可视化检测。该传感器由NLg、MPSm和GeNL三个组分组成,通过NLg与MPSm的特异性结合诱导纳米发光素重组,产生蓝光发射;同时GeNL能通过BRET产生绿光发射。OTA的浓度变化可通过微孔板读数机测量的发射峰强度比(λ₄₅₈/λ₅₁₈)以及智能手机拍摄的图像的蓝/绿通道比值进行定量检测。与单一信号检测相比,该RBL-免疫传感器表现出更稳定的检测性能,不受外部因素的干扰。优化后的传感器在微孔板读数机和智能手机上分别具有0.98 ng/mL和1.89 ng/mL的检测限,并显示出良好的选择性和准确性。该传感器成功应用于商品胡椒粉样品中OTA的快速检测,为食品安全监控提供了一种新的可靠工具。该工作为设计基于纳米抗体和模拟肽的便携式生物发光免疫传感器提供了新思路,具有广泛的应用前景。

参考文献：Xie, X.; Yang, X.; Zhang, Y.; Mao, F.; He, Z.; Sun, Z.; Zhang, S.; Liu, X., Ready-to-use ratiometric bioluminescence immunosensor for detection of ochratoxin a in pepper. Biosens. Bioelectron. 2024, 259, 116401.

来源：微生物安全与健康网，作者~曹璐璐。