中国工程院食品安全院士团队

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研究背景

在疾病诊断和食品安全领域，对生物分子的高灵敏度检测是一个重要需求。大规模传染病的频繁发生使得尽早诊断出患有传染病的患者变得至关重要，以便进行临床观察和控制，防止传染病的传播。

由于体内许多蛋白质分子的浓度非常低，因此在低丰度蛋白的检测中，信号放大是一个关键问题。富集低丰度蛋白大大增加了识别的可能性，并允许有效识别不易被检测到的蛋白质。分离和富集技术可以提高灵敏度、选择性和准确性。用抗体或寡核苷酸功能化的磁性纳米颗粒已用于样品中目标的预处理分离和富集。基于这些背景，文章提出了一种新的方法，通过结合毛细管磁分离富集和激光诱导荧光检测技术，来实现对生物分子的快速、高灵敏度检测。这种方法旨在简化操作步骤，实现快速分离、富集，并提高单位体积内目标分子的浓度，从而提高检测的灵敏度和效率。

设计毛细管磁分离-DNA设备

描述了使用毛细管作为分离通道，并利用流体拖曳力作为驱动力来实现生物分子的分离和富集。利用两种DNA探针和目标DNA形成的三明治结构与磁性纳米粒子结合，通过毛细管注射泵将混合溶液注入毛细管中，三明治结构被磁场力固定，并通过激光诱导荧光(LIF)检测器检测，实现了样本的在线分离、富集和检测。

Fig. 1. Scheme of capillary magnetic separation-DNA equipment: (A) The sample pretreatment. (B) The detection process.

设备对DNA检测的性能

研究了牛血清白蛋白(BSA)的浓度对荧光峰面积的影响，并确定了BSA最佳浓度为0.8 mg/mL。研究了不同流速对荧光峰形状和面积的影响，确定了最佳流速为150 μL/min。探讨了磁性纳米粒子的最佳浓度和cDNA的浓度对检测性能的影响，确定了MNPs和cDNA的最佳浓度分别为0.5 mg/mL、50 nmol/L。在最佳条件下，利用该方法对不同浓度的tDNA进行了定量检测，检测限为2.7 fmol/L。

Fig. 2. (A) Effect of BSA concentration on fluorescent peak area. (B) The chromatogram of different velocity. (C) The fluorescence peak area of different velocity. (D) The influence of different concentrations of MNPs. (E) Areas of fluorescence peaks corresponding to different concentrations of cDNA. (F) Calibration curve of tDNA concentration vs fluorescence peak area. (G) The detection of tDNA in 900 μL. (H) The fluorescence peak area of different DNA sequences.

凝血酶检测的可行性和分析性能

使用考马斯亮蓝法验证了cApt-29-MNPs成功捕获凝血酶的能力。研究了不同浓度的K⁺和Mg²⁺对凝血酶检测的影响，确定了Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)作为样品溶剂和分离缓冲液。确定了凝血酶与寡核苷酸的最佳孵育时间和温度，以及信号探针sApt-15的最佳浓度。在最佳条件下，该方法对不同浓度的凝血酶进行了检测，检测限为0.57 nmol/L。

Fig. 3. (A) Effect of the concentration of K⁺ and Mg²⁺. (B) Optimization of incubation time of thrombin with aptamer. (C) Fluorescence peak area of thrombin in 4°C, 22°C (room temperature) and 37°C. (D) Effect of the concentration of sApt-15. Calibration curves of different concentration of thrombin (E) 90 μL (F) 900 μL.

设备对S. aureus检测的分析性能

通过透射电子显微镜(TEM)图像证实了cApt-62-MNPs成功结合到S. aureus的表面。确定了MNPs探针和两种寡核苷酸（捕获探针和信号探针）的最佳浓度。在最佳条件下，建立了S. aureus浓度与荧光峰面积之间的相关性，并确定了检测限为3 CFU/mL。验证了该方法在实际样品（如经过紫外线消毒的瓶装水和自来水）中检测S. aureus的潜力，结果与平板计数法获得的结果相似，表明该设备具有实际应用潜力。

Fig. 4. (A) Effect of MNPs concentration on fluorescent peak area. (B) Effect of biotin-aptamer Ⅰ concentration on bacteria capture rate. (C) Effect of FAM-Aptamer Ⅱ concentration on fluorescent peak area. Calibration curves of detecting different concentration of S. aureus (D) 90 μL (E) 450 μL. (F) The specificity analysis of the proposed method (Bacterial concentrations were 3.3×10⁴ CFU/mL, 2.4×10⁴ CFU/mL, 3.2×10⁴ CFU/mL, 2.3×10⁴ CFU/mL, 1.6×10⁴ CFU/mL, 2.7×10⁴ CFU/mL, respectively).

结论：该研究成功地在毛细管中集成了分离、富集和在线检测，并将检测目标从DNA扩展到蛋白质和病原细菌，拓宽了应用范围。该方法具有高特异性和操作简单的优点，能够实现快速的分离、富集和检测，为环境检测和疾病诊断提供了一个有前景的工具。

参考文献：[1] CHENG S T, MENG R R, PANG Y H, et al. In-capillary magnetic separation and enrichment coupled with laser-induced fluorescence for rapid determination of biomolecules[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2024. DOI:10.1016/j.snb.2024.136840.

来源：微生物安全与健康网，作者~孙健.