中国工程院食品安全院士团队

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猪链球菌是猪的重要致病菌，可引发脑膜炎、败血症、关节炎等疾病，给养猪业带来严重的经济损失。同时，该菌也能感染人类，导致脑膜炎、败血症甚至死亡，是一种重要的人兽共患病原菌。1968年，丹麦首次报道了猪链球菌感染人类的病例，随后在亚洲、欧洲、南美洲、北美洲、大洋洲、非洲等地区均有猪链球菌感染人类的报道。在中国，1998年江苏暴发了猪链球菌感染人类疫情，共感染25例，其中14例死亡；2005年四川也暴发了猪链球菌感染人类事件，共感染215例，其中38例死亡；2006年之后，中国猪链球菌感染人类的事件主要发生在广西等地区。

研究方法

传统微生物学检测技术：

涉及对细菌的分离培养、生化鉴定和血清分型。将来自健康或发病动物的样品进行低温冷藏，并运送至实验室进行处理；样品经过匀浆后，将匀浆液加入到猪链球菌选择性液体培养基中，在37℃条件下培养；随后将培养物划线接种于加入5%脱纤维绵羊血的猪链球菌选择性固体培养基上，37℃培养后，挑取呈现草绿色α溶血环、针尖大小的菌落进行进一步的鉴定。传统的生化鉴定方法可参考文献，法国梅里埃公司将传统的生化鉴定试剂制备成微型化鉴定试剂盒，并基于统计学原理和计算机技术形成了API鉴定系统。

分子生物学检测技术：

① 普通PCR：根据猪链球菌特定基因设计引物，建立PCR检测方法。例如，Okwumabua等根据猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因（gdh）设计了引物，建立了PCR检测方法，但该方法无法区分猪链球菌和类猪链球菌。Ishida等基于猪链球菌重组/修复蛋白基因（recN）设计了引物，建立了更具特异性的检测方法。

② 多重PCR（m-PCR）：在常规PCR基础上发展起来，能同时扩增多个DNA片段，快速确定多种病原体或不同血清型。Silva等基于猪链球菌的管家基因gdh、荚膜（1、2、7 和 9 型）合成相关基因（cps）以及毒力相关基因（epf、mrp、sly 和 arcA）建立了m-PCR检测方法。

③ 荧光定量PCR检测技术：Nga等以cps2J为靶基因，建立了靶向检测猪链球菌血清2型的实时荧光定量PCR检测方法。Srinivasan等针对猪链球菌纤维连接蛋白结合蛋白基因（fbpS）开发了一种检测猪链球菌的荧光定量PCR检测方法。④ 环介导等温扩增技术（LAMP）：Huy等针对猪链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因设计了LAMP引物。Zhu等根据猪链球菌血清2型菌株 05ZYH33的89 kb毒力岛基因序列设计4条引物，应用LAMP检测了21株2型菌株、18株其他链球菌、9株葡萄球菌、5株其他种属菌株和49份未知样本。⑤ 可视化重组酶聚合酶扩增 - 侧流层析技术（RPA-LFD）：张闪闪等针对猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因（gdh）建立了可同时检测猪链球菌所有血清型的可视化RPA-LFD技术。

免疫学检测技术：

① 酶联免疫吸附试验（ELISA）：Vecht等建立了2种双抗体夹心法ELISA 用于检测猪链球菌，使用特异性单克隆抗体针对猪链球菌2型的2个毒力因子MRP和EPF。Del Campo Sepúlveda等将猪链球菌荚膜多糖作为抗原，建立了针对猪链球菌血清2型抗体的ELISA检测方法（CPS-ELISA）。

② 胶体金免疫层析法（GICA）：Yang等采用了标记有葡萄球菌A蛋白（SPA）的胶体金颗粒作为检测试剂，开发了一种用于检测猪链球菌2型抗体的GICA。Ju等采用柠檬酸还原法制备胶体金颗粒标记的猪链球菌2型多克隆抗体，建立了检测猪链球菌2型的GICA。

③ 免疫磁珠技术（IMS）：Gottschalk等开发了一种可以从扁桃体中富集猪链球菌血清2型或1/2型的IMS技术，采用超顺磁聚苯乙烯珠包被针对猪链球菌血清2型或1/2型的单克隆抗体（MAb）或纯化的免疫球蛋白G。

新型检测技术：

① 基于纳米材料的免疫传感器：Wang等构建了超灵敏增强化学发光（ECL）免疫传感器检测猪链球菌2型，其中HPtPd与葡萄糖氧化酶（GOD）联合构成双酶系统。Wang等制备了L-半胱氨酸（L-Cys）连接富勒烯（C60）功能化空心钯纳米笼（PdNCs）的纳米复合材料（C60-L-Cys-PdNCs），并固定在其上；GOD从葡萄糖中产生 H₂O₂，PdNCs分解H₂O₂生成O₂，从而增强S₂O₈²⁻ECL信号。

② 基于CRISPR-Cas平台的检测技术：Wang等通过结合RPA和CRISPR-Cas12a技术，建立了一种可以检测猪链球菌血清2型和1/2型的方法。Cards-SSJ法是基于猪链球菌血清2型 cps2J基因中高度保守的302 bp序列建立的检测方法。为了区分猪链球菌血清2型和1/2型，Wang等随后根据cps1/2K基因的第483位点开发了一种Cards-SSK法。

③ 融合机器学习的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：Wang等通过融合随机森林机器学习算法建立了检测猪链球菌血清2型并区分其毒力的MALDI-TOF MS 检测方法。

研究结果

传统微生物学检测技术：

传统的生化鉴定方法虽然可以对猪链球菌进行鉴定，但由于链球菌属细菌的生化试验反应较为活泼，菌株之间差异较大，且表型不稳定，因此还需要结合其他检测方法进行验证。

分子生物学检测技术：

① 普通PCR：普通 PCR 法更为快速简便，且具有较高的灵敏度和特异性，但鉴于猪链球菌的遗传多样性，近年来发现某些 recN阳性菌株并非猪链球菌，因此采用gdh和recN双阳性标准能更准确地鉴定猪链球菌。

② 多重PCR（m-PCR）：能同时扩增多个DNA片段，快速确定多种病原体或不同血清型，显著提高了检测效率。例如，Silva等的研究发现分离株存在24种不同的荚膜基因型，其中 45%的侵袭性猪链球菌疾病发病猪来源的猪链球菌由 cps2/mrp+/epf+/sly+和 cps9/mrp*/epf−/sly+两种基因型引起。

③ 荧光定量PCR检测技术：能解决免疫学检测的“窗口期”问题，区分当前感染和既往感染。Nga等建立的实时荧光定量PCR检测方法对猪链球菌血清2型的检测灵敏度为100%。

④ 环介导等温扩增技术（LAMP）：具有特异性强、灵敏度高、简单快速等特点，且不需要昂贵设备。Huy等的LAMP引物对4种细菌检测的灵敏度均为100 CFU/mL，与脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和大肠杆菌无交叉反应。

⑤ 可视化重组酶聚合酶扩增-侧流层析技术（RPA-LFD）：是一种快速、灵敏的恒温核酸扩增技术，无需特殊仪器，对检测人员技术要求低，更适用于临床快速检测。张闪闪等建立的 RPA-LFD法检测猪链球菌灵敏度可达 100 拷贝/μL，优于常规PCR法。

免疫学检测技术：

① 酶联免疫吸附试验（ELISA）：操作简单，其敏感性、特异性、稳定性较好，适用于临床大规模流行病学调查。Vecht等建立的ELISA方法可用于检测猪链球菌血清2型的致病菌株和非致病菌株。

② 胶体金免疫层析法（GICA）：具有操作方便、可视化、不需要复杂的专用设备等优点。Yang等开发的GICA的特异性和灵敏度分别为97.1%和86.3%，与ELISA结果高度一致。

③ 免疫磁珠技术（IMS）：具有操作简便、分离效率高、稳定性良好等优点，可以消除基质干扰并从复杂样品中富集目标检测对象。Gottschalk等的IMS技术检测血清1/2型的阳性率为100%，检测血清2型的阳性率为76%，均显著高于常规检测技术。

新型检测技术：

① 基于纳米材料的免疫传感器：具有更高的灵敏度，检测时间短，已广泛应用于病原检测领域。Wang等构建的ECL免疫传感器对猪链球菌2型核酸浓度在0.0001−100 ng/mL范围内呈线性相关，检出限为33 fg/mL。

② 基于CRISPR-Cas平台的检测技术：Cards-SSJ/K方法简单、快速、方便，非常适合临床检测。该方法鉴定出72份阳性样本，qPCR鉴定出71份阳性样本，而PCR法仅检测出31份阳性样本，Cards-SSJ/K和qPCR的检出率几乎一致，远高于PCR。

③ 融合机器学习的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：具有灵敏度高、分辨率高、图谱简明、速度快等优点，而且其制样简便，可实现微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品。Wang等建立的检测方法在区分猪链球菌2型与其他血清型方面的准确率为90.5%，在区分2型中的毒力菌株和无毒力菌株方面的准确率为92.7%。

研究与展望

当前，PCR技术依然是检测猪链球菌病原的主流手段，但其对专业人员、设备的依赖以及易污染等缺陷限制了其在基层的广泛应用。胶体金免疫层析法等免疫学检测技术虽然适用于临床快速诊断，但其灵敏度和准确性仍有待提升。免疫传感器结合纳米材料展现出灵敏度高、体积小、操作便捷、自动化等优势；CRISPR-Cas系统则以高灵敏度、强特异性及快速检测为特点；MALDI-TOF MS技术同样具备高灵敏度、高分辨率、图谱简明、检测速度快等优点，展现出良好的应用前景。然而，这些新型检测技术目前价格较为昂贵，临床应用推广尚面临一定难度。

在临床上，猪链球菌常与其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、副猪格拉菌等混合感染，且不同血清型猪链球菌的混合感染也颇为常见。因此，未来临床诊断的发展方向应根据猪链球菌混合感染的情况，建立准确、简便、快速、灵敏、特异且易于推广的检测方法。在实验室检测中，应考虑应用猪链球菌抗体或核酸类标准物质，以提高检测方法的准确性和可靠性。此外，微流控检测技术作为近年来发展起来的新型检测技术，具有样本需求量少、高通量、灵敏度高、易于集成和便携等优点，今后可考虑将该技术应用于猪链球菌检测。

参考文献链接：DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20240635

来源：微生物安全与健康网，作者~吴文卿。