干货速看！细胞培养污染防控全指南
发布时间：2025-10-28 浏览次数：11
细胞培养是生物制药、细胞治疗、基础科研等领域的核心技术支撑，其质量直接决定实验结论的可靠性、药品生产的安全性与细胞治疗的临床效果。在细胞体外培养过程中，污染是从业者常面临的 “棘手障碍”—— 它会悄然侵入培养体系，破坏细胞生长环境，导致细胞形态异常、代谢紊乱。
本篇系统梳理了三大污染源——支原体、细菌、真菌的生物学特性、污染典型表现、精准检测方法、科学清除策略，为细胞培养质量管控提供全面参考。
三大污染源——支原体、细菌与真菌
要实现污染的有效防控，首先需明确三大污染物的生物学本质。三者因分类地位、结构组成及代谢特性差异，在细胞培养体系中的滋生能力与污染风险各不相同：
支原体污染
支原体（Mycoplasma，又称霉形体）属于柔膜体纲（Mollicutes），是目前已知最小的原核生物之一，结构仅由脂蛋白膜、核糖体和圆形双链 DNA 组成（无细胞壁），基因组大小为 580-2,200 kb，生物合成能力有限（如无法自主合成胆固醇），需依赖外源营养补充。
细菌污染
细菌（Bacteria）属于细菌域，是单细胞原核生物，主要类群包括厚壁菌门、变形菌门等，结构含细胞壁（肽聚糖构成，革兰氏阳性菌壁厚、阴性菌壁薄且含脂多糖）、细胞膜、拟核（环状双链 DNA），部分有鞭毛或荚膜，基因组大小 1-10 Mb，营养需求因种类而异，部分需外源提供维生素、氨基酸等生长因子。
真菌污染
真菌（Fungi）属于真菌界，是真核微生物，分酵母型（单细胞）和霉菌型（多细胞，形成菌丝体），结构有完整细胞核（含线性染色体）、线粒体等细胞器及几丁质细胞壁，基因组大小 8-100 Mb，无法自主合成全部有机营养，需外源碳源（如葡萄糖）、氮源（如氨基酸）。
常见细胞培养基中的葡萄糖、谷氨酰胺、血清等成分，能满足支原体、细菌、真菌对营养的依赖，且 37℃恒温、适宜湿度的培养环境，为三者繁殖提供了理想条件；同时，支原体因无细胞壁、体积微小，易通过常规 0.22 μm 滤膜污染培养基，且对多种抗生素耐药；细菌繁殖速度快（代时20-60分钟），可通过污染的耗材（如未彻底灭菌的吸头）或不规范操作（如手部未消毒）进入体系，部分还能形成生物膜增强耐药性；真菌的孢子耐干燥、耐高温，可随气流扩散至培养瓶，且部分菌株（如白色念珠菌）对常用抗真菌药耐药，这些特性共同导致三者易在细胞培养中滋生并引发污染。
污染的典型表现
明确三大污染物的生物学特性后，掌握其在细胞培养中的典型表现，是实现 “早发现、早判断” 的关键。三类污染对细胞状态、培养基环境的影响存在显著差异，具体表现如下：
支原体污染
1
细胞生长停滞，贴壁细胞易脱落，染色体数目或结构异常。
2
细胞代谢通路紊乱，精氨酸消耗快，胞质出现细小空泡。
3
细胞膜抗原性改变，黏附能力下降，细胞功能活性降低。
4
支原体无细胞壁（0.1-0.3μm），普通光镜难识别，对青霉素耐药。
5
细胞复苏后存活率低，培养基无浑浊，隐性污染易被忽视。
细菌污染
1
培养基数小时内浑浊（菌种不同形态 / 颜色异常），pH 骤降。
2
细胞 1-2 天内大量死亡，贴壁细胞皱缩、悬浮细胞聚团破裂。
3
细菌产毒素破坏细胞膜，细胞内容物泄漏，细胞器溶解。
4
细菌快速耗尽培养基营养，细胞凋亡信号通路被激活。
5
细菌体积大，100-200 倍光镜易观察，繁殖扩散极快。
真菌污染
1
酵母型初期见细小乳白菌落，后期增多致细胞空泡化。
2
霉菌型先出纤细菌丝，后成绒毛 / 团状菌落，缠绕细胞。
3
细胞伸展不良、活性降低，核固缩、染色质边缘化。
4
真菌孢子耐高低温干燥，随气流扩散，致交叉污染。
5
霉菌产毒素损伤细胞 DNA，常规消毒难清除孢子。
传统检测法vsqPCR检测法
传统检测法
培养法作为《中国药典》推荐的金标准，对支原体通过观察 “煎蛋状” 菌落、细菌通过营养培养基上的特征菌落（如金黄色葡萄球菌的圆形金黄色菌落）、真菌通过沙氏培养基上的菌丝 / 孢子型菌落（如白色念珠菌的乳白色光滑菌落）进行鉴定，具有 “能确认活微生物污染” 的优势。但实际应用中存在共性局限性：
1
周期冗长：支原体需 7-14 天，细菌需 24-48 小时，真菌需 2-5 天，难以匹配生物制药、细胞治疗等领域 “快速排查” 的需求。
2
操作繁琐：需严格控制不同微生物的培养条件（如支原体对精氨酸 / 葡萄糖的依赖、真菌对沙氏培养基的特殊需求），且易受杂菌干扰。
qPCR检测法
近年来，以 qPCR 法（实时荧光定量聚合酶链式反应）为代表的快速检测技术实现突破。该技术基于传统 PCR 发展而来，通过在反应体系中加入荧光基团（如 SYBR Green 染料、TaqMan 探针），实时监测荧光信号累积，结合标准曲线完成未知模板分析。相较于培养法，qPCR 法优势显著：
1
检测速度快（2-4 小时完成），满足紧急排查需求
2
灵敏度高，检测下限低
3
特异性强（通过特异性引物 / 探针设计），避免细胞核酸或杂菌干扰
目前，qPCR 法已被广泛应用于生物制药、细胞治疗、科研实验室等场景，且得到行业标准认可 ——2025版中国药典新修订的《9201药品微生物检验替代方法验证指导原则》明确赋予三类技术法定地位：核酸扩增技术（如实时定量PCR）、基因指纹分析（如毛细管电泳）、全基因组测序技术（如NGS）。尤其适用于临床级细胞产品、疫苗生产等对检测时效与准确性要求高的领域。
污染清除方法
由于支原体、细菌、真菌的生物学特性（如有无细胞壁、繁殖速度、耐药性）差异显著，污染清除需遵循 “针对性选法、分级处理、兼顾细胞安全” 原则，具体方法如下：
共性注意事项：
1
先检测后清除：优先通过 qPCR 等方法确认污染类型，避免盲目用药；
2
优先保护细胞：所有清除试剂需做细胞毒性预实验，选择无毒性的有效浓度；
3
避免耐药性：单一药物连续使用不超过 4 代，可交替使用不同机制试剂；
4
彻底消毒环境：清除细胞污染的同时，同步消毒培养箱、超净台等，防止交叉污染；
5
重度污染优先丢弃：若细胞大量坏死或污染扩散风险高，直接丢弃以避免更大损失。
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