CCS控制：GMP环境浮游菌取样全流程

浮游菌取样是GMP环境微生物监测的核心环节，看似流程简单，实则每一步都直接关联监测数据的准确性与可靠性。作为质量检验人员，需深刻认知：取样过程中的任何微小疏漏（如采样头消毒不彻底、操作顺序颠倒、空白对照缺失等），轻则导致数据失真，引发不必要的偏差调查；重则误判洁净环境状态，给产品质量带来不可逆风险，甚至触发停产整顿。

我们需要严格依据GB/T 16293-2010《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》及行业实操经验，对浮游菌取样全流程进行深度细化，明确各环节关键控制点、操作规范、风险点及应对措施，助力检验人员精准规避常见“坑”，确保监测数据真实反映洁净环境状态。

一、取样前准备：源头把控，排除所有干扰源

核心目标：确保人员、仪器、耗材、环境均处于符合要求的状态，从源头杜绝外源污染对取样结果的干扰。本环节需完成“人员资质验证-仪器耗材核查-环境预确认”三大核心任务，缺一不可。

一）人员准备：资质与操作规范双达标

资质验证：取样人员必须经洁净区操作培训、微生物取样专项培训并考核合格，熟悉所涉及洁净级别的要求（如A/B级与C/D级的操作差异），掌握采样仪器的正确使用方法及应急处理流程。培训记录需归档备查。

规范更衣：

• 更衣流程需严格遵循SOP：依次进入一更（脱外衣、洗手）→二更（穿洁净内衣、洁净鞋）→三更（A/B级需穿无菌连体服、戴无菌口罩、无菌手套、无菌头罩；C/D级穿洁净连体服）。
• 无菌服检查：穿戴前需目视检查无菌服无破损、无污渍、无毛发附着，手套无漏洞（可通过充气法验证），口罩需完全覆盖口鼻，头发、胡须不得外露。
• 更衣后清洁：手部需用75%无菌乙醇擦拭消毒，消毒范围覆盖整个手掌、手背、指缝、指尖，自然干燥后再进入洁净区。

行为规范：进入洁净区后，动作需缓慢、轻柔，禁止奔跑、转身过快、大声交谈等行为，避免因气流扰动产生大量微粒（微粒会携带微生物，干扰采样结果）；禁止在洁净区内饮食、吸烟、存放个人物品。

站位原则预确认：提前熟悉采样区域布局，明确各采样点的位置，规划好采样时的站位——必须站在采样口的下风侧，身体与采样器、采样点保持直线距离≥30cm，不得横跨采样器与采样点之间的气流通道，防止人体散发的微生物污染采样区域。

二）仪器与耗材准备：逐件核查，确保无菌与合格

培养基准备与预培养（关键空白验证环节）：

• 培养基选择：优先使用符合GB/T 16293-2010要求的胰酪大豆胨琼脂（TSA），用于细菌培养；若需同步检测真菌/酵母菌，需额外准备沙氏葡萄糖琼脂（SDA）。培养基需在有效期内使用，外观无浑浊、无沉淀、无变色。
• 倒皿操作：在生物安全柜内进行倒皿，琼脂温度控制在45-50℃（温度过高会破坏培养基营养成分，过低易凝固无法均匀平铺），每皿倒液量为15-20ml（直径90mm平皿），倒毕后轻轻晃动平皿，确保琼脂均匀覆盖皿底，无气泡、无缺角。
• 预培养验证：倒好的平皿需倒置放入30-35℃恒温培养箱中培养48小时（SDA培养基检测真菌时，需在20-25℃培养5-7天），培养结束后目视检查，确认无任何菌落生长（即空白对照合格）。若出现菌落，需立即排查培养基灭菌不彻底、倒皿过程污染等原因，该批次培养基禁止使用，并记录偏差。
• 备用准备：根据采样点数量，额外准备10%-20%的备用培养基平皿，以防采样过程中平皿破损或污染。

浮游菌采样器核查：

• 校准验证：检查浮游菌采样器的校准证书，确认流量计、定时器均在校准有效期内（常规校准周期为6个月，若采样器出现故障维修后需重新校准）。校准记录需可追溯。
• 功能检查：接通电源，测试采样器的启停功能、流量调节功能是否正常，流量计显示是否稳定（误差需≤±5%），定时器设定是否准确。
• 清洁处理：采样前需用纯化水彻底清洗采样器表面、采样头、转盘及保护盖，去除残留的污渍和微生物，然后用干布擦干，待后续消毒处理。

其他耗材准备：

• 消毒剂：准备足量的75%无菌乙醇（需符合药用级标准，开启后注明使用期限，一般不超过7天），装入无菌喷壶或擦拭瓶中；若采样区域有特殊污染风险，可额外准备过氧化氢消毒湿巾。
• 密封与标记用品：准备无菌封口膜、防水标记笔、采样记录单，标记笔需提前确认书写清晰、不易褪色。
• 运输容器：准备带缓冲垫的无菌运输箱（内置冰袋，控制温度在2-8℃，避免培养基变质），运输箱需提前清洁消毒。

三）环境预确认：确保采样环境稳定

提前与生产部门沟通，确认采样时间避开生产高峰期和设备清洁消毒后初期（消毒后残留的消毒剂会影响微生物存活）。采样前检查洁净室的HVAC系统运行状态，确保已连续正常运行至少30分钟（单向流洁净区可缩短至10分钟）；用经校准的温湿度计、压差计测量环境参数，确认温度控制在18-26℃，相对湿度45-65%，压差符合要求（洁净区与非洁净区压差≥10Pa，不同级别洁净区之间压差≥5Pa）。若环境参数不稳定，需暂停采样，待参数稳定后再进行。

二、现场取样操作：精准执行，细节决定结果可靠性

本环节是浮游菌取样的核心，操作顺序和细节把控直接影响数据准确性。必须严格遵循“环境确认→仪器消毒→空转去残留→放置培养皿→设定参数→启动采样→过程监控”的流程，严禁颠倒或省略步骤。

一）仪器消毒与去残留：核心防污染步骤

表面消毒：将采样器搬运至采样区域后，用75%无菌乙醇擦拭采样器表面（从内到外、从上到下，同一方向擦拭，避免交叉污染），重点擦拭采样头、转盘、保护盖及操作按钮，擦拭后自然干燥2-3分钟（确保乙醇完全挥发，避免残留）。若采样头可拆卸，可将其浸泡在75%无菌乙醇中消毒30分钟，然后用无菌镊子取出，自然干燥。

空转去残留（关键风险控制点）：消毒完成后，暂不放入培养皿，将采样器的保护盖取下，开启采样器，设定流量为采样所需流量，空转5分钟以上（若采样器体积较大，可延长至10分钟）。风险点警示：若省略空转步骤，仪器内部残留的乙醇蒸气会被吸入采样气流中，杀死空气中的微生物，导致假阴性结果（实际环境有菌但未检出），严重误导环境质量判断。空转过程中需确保采样口朝向洁净区气流方向，避免吸入非采样区域的空气。

二）培养皿放置：无菌操作贯穿始终

在生物安全柜或洁净台内进行培养皿放置操作，操作前需用75%无菌乙醇擦拭生物安全柜的工作台面，开启紫外灯消毒30分钟，然后关闭紫外灯，通风10分钟。

用无菌镊子取出经预培养合格的培养基平皿，轻轻揭开皿盖（注意手不得触碰皿盖内侧和培养基表面，皿盖开启角度≤45°，避免空气中的微生物落入），将平皿平稳放入采样器的托盘中央，确保平皿与转盘贴合紧密，不会在采样过程中晃动。

放置完成后，盖上采样器的保护盖，注意保护盖的内侧不得触碰任何非无菌表面。

三）采样参数设定：按洁净级别精准调整

采样量设定：根据洁净区级别严格设定采样体积，不得随意调整。具体参考如下：

• A级/ISO 5级洁净区：最小采样量1000L（若环境微生物污染风险较高，可适当增加至1500L）；
• B级/ISO 6级洁净区：最小采样量1000L；
• C级/ISO 7级洁净区：最小采样量500L；
• D级/ISO 8级洁净区：最小采样量100L。

采样点布置与高度：

• 布置原则：采样点需均匀分布在洁净区的关键操作区域（如灌封岗位、配料岗位）、人员活动频繁区域和气流死角区域，避免集中在一个区域。采样点数量参考：面积≤10㎡的洁净区至少设2个采样点，面积＞10㎡的每增加10㎡增设1个采样点，且最少不低于3个。
• 高度设定：采样点高度通常为离地0.8-1.5m，或与关键操作面（如灌封机台面、操作台）高度一致；若需监测天花板附近的微生物状态，可增设1个离地2.0-2.5m的采样点。
• 避开干扰源：采样器放置位置需远离回风口、送风口正下方（距离≥1m），避开人员频繁走动的通道、设备排气口、物料堆放区域，防止气流扰动和人员活动对采样结果产生干扰。

四）采样过程监控：全程把控，避免数据无效

启动采样：确认参数设定无误后，按下采样器启动按钮，同时记录采样开始时间。采样过程中密切观察流量计显示，确保流量稳定（若流量波动超过±5%，需立即停止采样，排查原因后重新采样）。

现场防护：采样人员需始终保持在采样口下风侧，不得随意走动或触碰采样器；禁止其他人员在采样区域停留、交谈或进行其他操作。

异常处理：

• 异常情况警示：若采样过程中发生断电、设备故障、人员意外触碰采样器、大量粉尘落入采样区域等情况，该次采样数据视为无效，需在采样记录单中注明原因，重新选择采样点进行采样（重新采样需更换新的培养基平皿和消毒仪器）。
• 采样结束：采样器自动停止后，记录采样结束时间和实际采样体积。等待采样器转盘完全停止转动后，再缓慢取下保护盖，避免气流扰动导致培养基表面污染。

三、取样后处理：严防二次污染，确保数据可追溯

采样后的培养皿、仪器及记录处理，核心是“无菌密封、清晰标记、及时送检”，避免运输和储存过程中的二次污染，确保数据可追溯。

一）培养皿密封与标记：细节决定可追溯性

密封操作：在洁净环境中，用无菌镊子轻轻取出采样后的培养皿，迅速盖上皿盖（盖盖时避免产生气流，防止空气中的微生物落入）。用无菌封口膜缠绕培养皿边缘2-3圈，密封紧密（防止运输过程中皿盖脱落、冷凝水渗入或微生物污染）。

清晰标记：用防水标记笔在培养皿底部（避免遮挡菌落观察）清晰注明以下信息：采样日期、采样时间、采样点编号（如A-01，代表A级洁净区1号采样点）、洁净级别、检验人员姓名、培养基类型（如TSA/SDA）。标记信息需完整、准确，不得遗漏。

空白对照处理：将同批次未打开皿盖的空白对照培养皿（数量不少于2个，分别用于细菌和真菌检测）与采样后的培养皿一同密封、标记，空白对照需注明“空白对照”字样。

二）仪器清洁消毒：避免交叉污染

采样结束后，立即用75%无菌乙醇擦拭采样器表面、采样头、转盘及保护盖，去除残留的培养基和微生物；若采样过程中有培养基溢出，需先用纯化水清洗，再用乙醇消毒。消毒后的采样器放入洁净的收纳盒中，带回检验室，待后续彻底清洁（用纯化水冲洗后，干燥存放）。

三）及时送检与记录：确保数据有效性

送检时限：将密封标记好的培养皿（包括空白对照）放入提前准备好的无菌运输箱中，确保平皿平稳放置、无碰撞。送检时间不得超过4小时（若无法及时送检，需将运输箱置于2-8℃冷藏环境中暂存，但暂存时间不得超过24小时，且需在记录中注明暂存情况）。

运输过程监控：运输过程中避免运输箱剧烈晃动、暴晒或高温环境，确保箱内温度稳定在2-8℃。运输人员需轻拿轻放，尽快将培养皿送至微生物实验室。

采样记录完善：及时填写采样记录单，详细记录以下信息：采样日期、时间、地点、洁净级别、采样点编号及位置、采样体积、环境温湿度/压差、采样器型号及校准情况、培养基批次及预培养情况、采样人员、送检人员、运输方式、异常情况及处理措施等。记录单需字迹清晰、信息完整，签字确认后归档。

四、常见洁净级别采样量及培养条件参考表

特别提示：

TSA（胰酪大豆胨琼脂）：适用于大多数细菌的培养，营养成分全面，能满足浮游菌中常见细菌的生长需求；

SDA（沙氏葡萄糖琼脂）：适用于真菌、酵母菌的培养，含糖量较高，pH值偏酸性，利于真菌生长；

若采样区域存在特殊微生物污染风险（如霉菌高发区），需同时使用TSA和SDA两种培养基进行采样；

菌落计数限值参考GB/T 16293-2010及GMP附录《无菌药品》要求，具体可根据企业内部质量标准调整，但不得低于国家标准。

五、核心原则与常见问题应对

一）三大核心原则（必记）

先空转，后放皿：仪器消毒后必须空转去残留，这是避免假阴性结果的关键；

人站下风侧：采样时严格遵守站位要求，防止人体微生物污染采样区域；

带空白对照：每批采样必须设置空白对照，空白对照长菌则整批数据作废，这是验证数据有效性的核心依据。

二）常见问题及应对措施

空白对照长菌：

• 原因：培养基灭菌不彻底、倒皿过程污染、密封不严导致运输过程污染、培养箱污染；
• 应对：立即停止该批样品的检测，排查污染原因，重新制备培养基、清洁消毒培养箱，更换所有耗材后重新采样。

采样后培养皿无菌落生长，但实际环境存在污染风险：

• 原因：仪器消毒后未空转，残留消毒剂杀死微生物；采样量不足；采样点选择不当，未覆盖污染区域；培养基失效；
• 应对：检查采样过程是否符合规范，重新确认仪器空转步骤、采样量设定，更换新的培养基，调整采样点位置后重新采样。

采样过程中流量波动过大：

• 原因：采样器故障、采样头堵塞、气流不稳定；
• 应对：立即停止采样，检查采样器是否正常，清理采样头的堵塞物，待气流稳定后重新采样，更换新的培养基平皿。

培养皿菌落计数超标：

• 原因：洁净室HVAC系统故障、人员操作不规范、设备清洁消毒不彻底、物料带入污染；
• 应对：立即上报质量部门，启动偏差调查，排查污染源头，对洁净室进行重新清洁消毒，待环境参数恢复正常后重新采样验证。

六、总结

浮游菌取样是GMP环境质量监控的“眼睛”，检验人员的每一个操作都直接关系到产品质量和患者安全。作为检验人员，必须牢记“无菌观念为先，细节把控为要”，严格遵循本指南的全流程要求，落实各环节的关键控制点，避开常见风险点，确保监测数据真实、准确、可追溯。同时，需定期参加培训，积累实操经验，不断提升应急处理能力，为企业的质量安全防线筑牢基础。

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