RAW264.7细胞培养与M1/M2极化诱导操作指南

一、Raw264.7 是谁？为什么实验室都爱它？

Raw264.7 是小鼠白血病病毒诱导的 巨噬细胞系，堪称免疫学界的“标准模特”。
巨噬细胞在体内身兼多职：吞噬病原体、呈递抗原、分泌细胞因子、调节炎症和组织修复……而 Raw264.7 因为 生长稳定、易于转染、极化响应明确，成为体外研究 M1 促炎型 和 M2 抗炎/修复型 极化的首选工具。

无论你是想探究炎症机制、肿瘤免疫，还是药物筛选，掌握它的极化操作，都是基本功。

二、基础培养-养出“白白胖胖”的好细胞

1、培养基配方

• 基础培养基：DMEM 高糖（含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠更佳）
• 血清：10% 优质胎牛血清（FBS）——血清质量直接决定细胞状态，建议提前筛选批次
• 双抗：1% 青霉素/链霉素（100 U/mL / 100 μg/mL）

！注意：部分实验室不加双抗，以减少对抗生素的依赖，但前提是操作环境洁净。

2、培养环境

• 温度：37°C
• CO₂：5%
• 湿度：饱和湿度（培养箱底层放无菌水盘）

3、传代（关键细节！）

Raw264.7 贴壁不牢，增殖极快，一般 2~3 天 即可传代。

• 传代时机：融合度达到 80%~90% 时进行，切勿超过 95%，否则细胞会自发分化或凋亡。

• 操作步骤：

  1. 吸去旧培养基，用无菌 PBS 轻洗 1 次（去除残留血清）。

  2. 加入新鲜培养基，用 细胞刮刀 或 移液枪吹打 将细胞从瓶底吹下（不用胰酶！胰酶会损伤表面受体，影响后续极化）。

  3. 收集细胞悬液，计数后按 1:3~1:5 比例接种到新培养瓶。

  4. 吹打不下来的细胞往往是已贴壁极化的细胞，建议弃去，以保证传代后细胞均一性。

★ 冻存与复苏

• 冻存液：90% FBS + 10% DMSO（或商品化无血清冻存液）。
• 冻存密度：5×10⁶ ~ 1×10⁷ cells/mL，分装于冻存管，程序降温盒 -80°C 过夜后转液氮。
• 复苏：快速 37°C 水浴融化，稀释到预温培养基中，离心（200×g，5 min）去除 DMSO，重悬后铺瓶。复苏后至少传代 2 次 再用于实验，让细胞恢复最佳状态。

三、极化前准备——同步化“待命”

1，铺板密度

！密度需根据实验时长调整：刺激 24 h 的，密度可稍低；刺激 48 h 的，需降低初始密度，避免过度拥挤。

2，饥饿同步化

铺板后，待细胞贴壁过夜（约 12~16 h），吸去含血清培养基，换成 低血清培养基（DMEM + 0.5%~1% FBS）或 无血清 DMEM，继续培养 **6~24 h**。

• 目的：让细胞周期同步，降低基础炎症信号，使后续刺激响应更一致、更灵敏。

• 饥饿时间建议 12 h 为起始，可根据细胞状态微调（饥饿太久会导致细胞脱落）。

四、重头戏——M1 / M2 极化诱导

1，M1 型（经典激活，促炎）

• 诱导剂：LPS（脂多糖）100 ng/mL + IFN-γ（小鼠重组）20 ng/mL

• 载体：用低血清培养基配制工作液，替换饥饿后的旧培养基。

• 刺激时间：24 h 通常可获得稳定 M1 表型；部分实验可缩短至 6~12 h 观察早期炎症因子，或延长至 48 h 观察持续效应。

• 阳性对照：可单独加 LPS（100 ng/mL）作为基础炎症对照。

2，M2 型（替代激活，抗炎/修复）

• 诱导剂：IL-4（20 ng/mL）+ IL-13（20 ng/mL） ——公认“黄金搭档”

• 同样用低血清培养基配制，刺激时间 24 h。

• 部分文献单独使用 IL-4（40 ng/mL）也能诱导，但联合 IL-13 效果更稳定。

3，操作细节（别漏掉！）

• 换液方式：吸去饥饿培养基，加入含刺激剂的新鲜低血清培养基（2 mL/well 对于 6 孔板）。

• 设置对照组：必须保留 未刺激组（只加低血清培养基，不加任何因子），作为基线对照。

• 建议设溶剂对照（如 PBS 或载体溶液），排除溶剂干扰。

五、极化后收样 & 检测-怎么知道“变”成功了？

1，形态学（仅供参考）

• M1 倾向 铺展、呈星形或梭形，伪足增多；

• M2 相对 圆形或椭圆形，贴壁较松散。
  ！形态变化受培养基、血清批次影响大，不能作为判定依据。

2，分子标志物

！取样时间建议：刺激结束后 尽快 提取 RNA 或蛋白，或收集上清。表型随时间漂移，建议固定时间点（如 24 h）统一收样。

3，额外进阶——ROS 检测（你的专业领域！）

极化过程中，M1 型会爆发 呼吸爆发（respiratory burst），产生活性氧（ROS），这是杀菌和促炎的重要机制。
如果你要检测 ROS，可以在极化结束前 1~2 h 加入 DCFH-DA（10 μM） 或 DHE（5 μM） 探针，37°C 避光孵育，然后用流式细胞术或荧光酶标仪检测。

• 注意：探针孵育后需用 PBS 洗涤 2~3 次，去除背景荧光。

• 建议设置 阳性对照（如 H₂O₂ 处理） 和 阴性对照（无探针），确保信号特异。

六、 Tips

1. 试剂浓度不是死的：文献给的浓度是起点，务必在自己的细胞代次、血清批次下做 预实验梯度（如 LPS 50~200 ng/mL，IFN-γ 10~50 ng/mL）。

2. 刺激剂质量决定成败：LPS 要用超纯级（避免 TLR2 污染），细胞因子要选 重组、低内毒素、无菌分装，避免反复冻融（建议分装后 -80°C 保存，一次一支）。

3. 对照！对照！对照！：没有未刺激对照，所有上调下调都缺乏依据。最好再加 同型对照抗体（流式时）。

4. 收样速度要快:RNA 提取前用 PBS 洗一次，立即加裂解液；蛋白样本加蛋白酶/磷酸酶抑制剂；上清收集后离心去除细胞碎片，冻存于 -80°C。

5. 记录习惯:每次记录细胞代数、铺板密度、饥饿时长、刺激批次、收样时间。你会发现，回头排查问题时，笔记就是救命稻草。