qPCR实验操作全攻略：从原理到加样细节的完整指南
发布时间：2026-07-27 浏览次数：16
今天要分享的是如何进行qPCR实验（这是我为数不多拿到出手的实验操作）。这一篇章我将主要介绍实验目的，实验原理，实验操作步骤，注意细节这四方面的内容。后面会再介绍软件使用以及数据处理部分。
实验目的：就是可以定量某个特定基因的表达量。
实验原理：以cDNA为模板进行PCR扩增，同时在PCR体系中加入荧光标记物，通过荧光信号来检测每个产物扩增量的变化，在同一扩增量的情况下，检测扩增数目，便可以对原始模板的基因表达量进行定量分析。
实验材料：模板（cDNA），引物，酶，水，荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 Touch)
实验步骤：
1，实验设计，确定样本和基因，以我的实验为例，我有两个样本,我需要测定的是这两个样本中多个基因的一个表达情况，我就设计了如下的实验图：
在这个实验中，我想探究的是对照组和处理组细胞系中的cDNA中几个基因的表达情况。纵向代表的是我的样本，B和Breg，横向代表的是我的基因，我想看那几个基因的表达情况，注意一下要设置一个内参基因，这样才能看目的基因的一个相对表达情况，常见的内参基因包括：β-Actin，GAPDH。
每个样本做3-4个技术重复，之前我做的是4个技术重复，这里样本比较多，所以做了3个重复。
2，加样设计，每个孔里需要加的试剂包括：模板，引物，酶和水，总体系是20ul，用水补齐。具体来说：模板就是cDNA，稀释成100ng/ul加2ul也就是200ng，引物0.4ul（一对引物0.8ul），7.8ul的水补齐一共是20ul。
加样技巧：水和引物混匀，模板和酶混匀。
水和引物混匀：第一个引物β-Actin，一共6个孔需要，每个孔引物0.4，我会多两个孔按照8个孔去计算：上游引物：0.4*8=3.2ul，下游引物：0.4*8=3.2ul，水7.2*8=57.6ul。本实验中一共配制16个引物，每个引物加6个孔。
模板和酶的混匀：注意酶是避光的，一共48个孔，可以配制51个孔的样：51*2=104ul，51*10=510ul。配成的混合液吹打混匀之后加入个个孔里。
3，最后贴上封板膜，离心800g 1min。
注意细节：荧光定量PCR是一个定量实验，因此对实验的精确的要求较高，有许多需要注意的细节：
① 注意混匀，模板要混匀，引物混匀，配制成的引物水混合物以及酶和模板的混合物也要混匀。
② 加样的时候特别容易加错，可以要加样的孔和96孔板的枪头盒对应起来，这样作为一个对照，起到再一次核对的效果。
③ 模板和酶最后加，要注意避光。
以上就是qPCR实验的设计和加样篇，我会尽快更新荧光定量qPCR仪软件的使用以及数据处理！
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