中国工程院食品安全院士团队

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摘要

目的：比较生化与分子生物学两种方法对坏的蠵龟蛋微生物种群的鉴定。

方法与结果：对两种生化方法（API和Microgen）与一种分子生物学方法（16S rRNA序列分析）在成本、鉴定、其它方法的数据确证、便于使用、资源和软件等方面进行比较。

结果，分子生物学方法是昂贵的，并且经过测试相对于采用API方法的74%只有66％的分离率被识别。一个74%的鉴定差异发生在API与16S rRNA分析之间。而两个生化鉴定方法成本可相媲美，但Microgen更容易使用，并且与API 20E和API 20NE联合使用结果相比较，所产生的鉴定差异是最小的（29%）。

结论：Microgen识别系统似乎比API或16S rRNA序列分析更适合用于鉴定蠵海龟蛋中的微生物种群。

研究的意义和影响：

大多数的鉴定方法并不用于微生物的环境分离。而鉴定系统的相互比较将为生态学研究中环境细菌的鉴别提供更好的选择方法。

简介：
蠵海龟是最常见的海龟种，筑巢于格鲁吉亚且部分嗜温的种群分布于美国(Bo-wen and Karl 1997)。虽然全球范围内蠵海龟的平均孵化成功率大于80%(Miller 1997)，但于2006年蠵海龟在全格鲁吉亚的孵化成功概率只有63%。而在吉柯岛，一个格鲁吉亚的最南端的屏障岛屿，在2006年的产卵季节，孵化成功率只有52.5％(Dodd and Mackinnon 2006)。

在2004年，我们发起了一个长期的研究，探讨蠵海龟蛋的变质和蛋胚胎死亡过程中微生物污染的潜在作用。迄今为止很少有研究鉴别出与未孵化的海龟蛋相关的微生物(Wyneken et al.1988;Girondot et al.1990;Mo et al.1990)。

在2004,2005和2006年的8月和9月期间，从巢里收集蠵海龟蛋。将从海龟蛋外表面收集的微生物种群与从胚胎液体中分离的微生物种群相比较。初步结果表明，微生物污染可能会在海龟蛋坏死中发挥作用，肠道病原体可能会导致胚胎死亡(Cravenet al.2007)。在我们3年的研究中，利用了几种方法来鉴定分离细菌。在这份报告中，我们评估了三种不同的常用于环境细菌鉴定分离方法的表现。

目前用于检定与识别细菌分离株的方法包括各种常规的表型，生化，酶和分子生物学检测(Krieg 1994;Smibert and Krieg 1994;Baron et al.1995;Miller andO’Hara 1995)。利用表型和生化检验用于细菌的鉴定是多年的传统标准。这些测试系统的数量近年来得到了增长。目前，有许多商业化的多重测试系统可供使用。生化系统在传统上一直用于鉴定如弧菌和肠杆菌科成员的特定临床病原体。尽管有些研究显示出与这些鉴定系统相关的高精确率报导(Sogaard et al.1986;O’Hara et al.2003;Croci et al.2007)，但一些另外的研究却报导出了这些系统不太令人满意的病原体鉴定结果。(Israil et al.2003;Colodner et al.2004;Martinez-Urtaza et al.2004)。此外，因为环境细菌在计算机化的数据库信息不足，基于生化反应的鉴定系统可能无法可靠地对环境细菌分离鉴定。

近年来，分子生物学方法已用于微生物的常规鉴定，或作为丰度，多样性和系统发育研究的直接措施(Krieg 1994;Gevers and Coenye 2007;Liu and Stahl 2007)。常见的方法包括核酸序列修复的使用，基因组DNA杂交，核酸指纹和核酸扩增。虽然分子生物学方法已被证明是非常敏感的，但他们有自己的局限性。核酸扩增程序能够确定特定微生物的DNA或RNA是否在目前的样品中，但不能确定生物体的生存能力。分子生物学的方法总是局限于细菌数据库大小的程度，而且往往需要复杂的程序，训练有素的人员和昂贵的专用设备。

在我们的第一个3年的研究中，针对环境分离鉴定的微生物，我们比较和评估了三个不同的方法：生物梅里埃（API 20E）和（API 20NE）识别系统(Biomerieux,Marcy l’Etoile,France;www.industry.biomerieux-usa.com)，Microgen的GNA和GNB生化检测试剂盒(Microbiology International,Surrey,UK;www.microgenbioproducts.com)，和Accugenix的16s rRNA 基因的遗传分析(Accugenix,Newark,DE,USA; www.acugenix.com)。考虑的因素包括识别的能力，与其他方法的确证，成本，易用性，指示系统和网络资源，并提供的数据库/计算机软件。，因为是否分离到肠杆菌科的不确定性，所以API 20E和API20NE同时使用。据推测，来自雌性海龟阴道的肠道致病菌可能会在产卵期间转移到海龟蛋中。Microgen的检测试剂盒作为一种替代测试。因为他们并不需要两个单独的鉴别（肠道和非肠道）检测。

材料和方法：
海龟蛋收集

在2004，2005和2006年的8月和9月期间，从11个乌龟巢中共收集70只未孵化的，完整的蠵海龟蛋。所有的巢都在美国佐治亚吉柯岛上完成孵育。海龟蛋的收集在幼体出现后的3-5天后进行，或开始孵化的70天后（足月孵化为60-70天）。海龟蛋（和窝里的沙一起）被收集到储存于室温下的无菌纸袋中存放，并运往美国佐治亚州，萨凡纳，阿姆斯特朗大西洋州立大学进行处理。海龟蛋的加工处理过程在2~4小时之内完成。来自健康的巢穴（受控巢穴）的蛋不能被收集，因为这与受到威胁的物种--海龟是对立的。

细菌的分离和鉴定
每个巢随机抽取3~6个海龟蛋用于细菌的分离。接着，除去蛋表面的巢沙。使用无菌棉签转移和分离的蛋表面的细菌。为了确定与胚胎液相关的细菌群体，蛋首先浸没在过氧化氢中5分钟，接着浸入95%乙醇中3分钟以消毒。再用聚维酮碘消毒蛋的表面，用无菌剪刀和镊子移除一块蛋壳。
用无菌棉签或无菌巴斯德吸液管来获取胚胎流体样品。被分离的细菌使用区域划线隔离技术，生长在（TSA）和（ＭＡ）培养基上，30℃下、24~48 h。分离的细菌均保存在TSA和ＭＡ琼脂斜面上。革兰氏染色使用Hucker染色法、孢子染色使用谢弗弗尔顿染色法（Murray等al.1994）。

生化方法

分离株的生化鉴定使用市售的微型多测试识别系统：API（Biomerieux）及Microgen（Microbiology International）。接种每个鉴定系统之前，每个分离株都来自于一个24h TSB培养后重新接种到TSA平板上获得的用于测试目的单独菌落。

API 20E
    API 20E鉴定系统是专为鉴定肠杆菌科细菌和其他非苛养革兰氏阴性菌成员的测试条。
测试条根据提供的说明进行接种和培养。无菌0.85％盐溶液作为阴性对照，而变形杆菌作为阳性对照。采用API网络软件进行鉴定，并且当鉴定结果符合率在80%或更好时被认为是可以接受的。(Biomerieux)。

API 20NE

API 20E鉴定系统是专为鉴定非苛养，非肠道革兰氏阴性菌成员的测试条。根据提供的说明进行接种和培养。无菌0.85％盐溶液作为阴性对照，而绿脓杆菌作为阳性对照。采用API网络软件进行鉴定，并且当鉴定结果符合率在80%或更好时被认为是可以接受的。(Biomerieux)。

API CHB/E
API CHB/E鉴定系统是用于鉴定芽孢杆菌及其相关属。它还用于属于肠杆菌科细菌的革兰氏阴性杆菌和弧菌家族的鉴定。测试条根据提供的说明书来接种与培养。采用API网络软件进行鉴定，并且当鉴定结果符合率在80%或更好时被认为是可以接受的。(Biomerieux)。

Microgen GN A and GN B
Microgen GN A是最常遇到的肠杆菌科成员12种反应底物固化的鉴定系统。GN A + B系统是目前公认的非发酵，革兰阴性杆菌，加氧化酶阴性肠杆菌科的所有物种的综合识别系统。它还确定了11个属的氧化酶阳性，不苛养，革兰阴性杆菌属。测试条根据说明书提供的指示来接种和培养。对于这两项GN A和GNA+B测试，采用无菌0.85％生理盐水作为阴性对照。而大肠杆菌和变形杆菌被用来作为阳性对照。鉴定结果通过使用Microgen鉴定系统获得。

分子生物学方法
27个随机挑选的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株挑染到TSA平板上，然后转接到微生物鉴定Accugenix上。Accugenix的鉴定系统是基于16S rDNA序列和自动化核糖分型（Accugenix2007年）的联合。用于遗传分析选定的分离菌株均来自从2005年筑巢季节期间收集的海龟蛋中。

结果

API与Microgen的比较

比较采用31株菌株API与Microgen的鉴定情况，API 20NE系统鉴定了28株（90%），API 20E系统鉴定了18株（58％）和Microgen系统鉴定了31株（100%）（见表1）。
然而，只有65％的菌株经由API 20NE系统和26％菌株经由的API 20E系统鉴定分离被认为是可接受的（鉴定概率等于80％或更高）。同样，虽然100％的菌株经由Microgen确定，但也只有68％的鉴定是（高于80%）可以接受的。相比较结果，在API 20NE与Microgen之间产生了一个52%的鉴定差异，而在API 20E与Microgen之间产生了78%的鉴定差异。然而，当Microgen的数据API20NE和API20E合并后的数据相比，这种鉴定差距下降到38％，即确定了12株由Microgen识别而API20NE或API20E两者之一单独无法鉴别的菌株被鉴定。仔细观察显示一直有差异的12个菌株的鉴定数据，两个API的数据库对其中的3株菌株表现出完全没有数据。考虑到这一点，Microgen的结果和联合的API结果之间的差异，下降到29％。Microgen的鉴定，因此，配合API的两个测试最终可以鉴定71％的菌株。API 20E和API 20NE之间的鉴定差异是比较高的（83％）。绿脓杆菌和苍白杆菌是唯一经由 API20NE和API20E同时鉴定的菌株。通过两种方法正确的操作鉴定过程是严受到格控制的。

API 与Accugenix的比较

相比较API和Accugenix用于革兰氏阴性菌株的鉴定，API鉴定了86%的测试菌株，而Accugenix只鉴定了66%（见表2）。API鉴定系统能够识别所有的测试菌株到属、种的水平。而通过Accugenix鉴定的66%的菌株中，86％被确定到种，14％只能确定到属。通过Accugenix系统，共有7株菌株不能被识别，其中四株给出了匹配为最接近可能的鉴定结果，而另三株则完全无法识别。API与Accugenix鉴定结果的比较产生了出了72％的鉴定差异。菌株J66UH2F4通过APi鉴定为:嗜麦寡养单胞菌，而通过Accugenix鉴定为:弯曲假单胞菌。通过审查表型分支树表明，这两种生物体的密切相关性只有（1.52%）。而当不能给出鉴定数据时，Accugenix将提供最接近的相关鉴定。但在所有情况下，即使是最接近的鉴定结果也无法与API的鉴定结果相吻合。

表1：革兰阴性杆菌的细菌鉴定：API（20E和20NE）VS Microgen

*：未在Mirogen的数据库中。
！：未在API的数据库中。

对于革兰氏阳性菌株，API只能鉴定出6株测试菌株中的2株（33%）（表3）。而Accugenix鉴定出了全部的6株。但其中一株[J66UH3OS（1）]产生了多重的鉴定结果，并且另外还有三株只能被鉴定到属的水平（表3）。总体而言，相比较于Accugenix系统的检出率70%（单独菌株被检出多重的鉴定结果被视作为：NO ID），API系统对于总测试菌株样品检出率达到了74%。最大的差异发生于革兰氏染色阳性菌株鉴定中，数据结果的比较在两种检测方法之间产生了一个74%的差异。通过两种方法正确的操作鉴定过程是受到严格控制的。

讨论
    在试图确定将来自坏死蠵海龟蛋中环境细菌的分离鉴定最有效果和有效率的方法，我们比较和评估了一项为期三年跨度的三个细菌鉴定系统。在我们研究的第一年，细菌分离株通过使用API 20E、API 20NE与API CHB/E鉴定系统来鉴定。API系统被广泛应用于整个美国并且作为一项“金标准”被其它的鉴定系统作为比较对象。虽然，已有众多的研究针对临床菌株进行了API与其它市售鉴定系统的比较，但只有少数研究进行了环境中分离株的API与其它方法的鉴定比较。(Brown and Leff 1996;Johnsen et al.1996;Toti et al.1996; Truu et al.1999;Israil et al.2003)。为了确定的API系统用于鉴定与蠵海龟蛋相关联的环境细菌的作用，我们用API与其它的鉴定系统做了比较。由于涉及16S rRNA基因测序的分子生物学方法，现在经常使用的细菌鉴定，从第二年数据分离株随机被取用于16S rRNA序列分析鉴定与API系统相比较。
 

表2：革兰阴性菌株的细菌鉴定：API（20E和20NE）VS  Accugenix

表3：革兰氏阳性菌株的细菌鉴定：API（CHB/E） VS  Accugenix

作为一个额外的比较，我们拿API与另一个较新的生化系统（Microgen GN A和GNB鉴定试剂条）进行对比，在我们研究的第三个年头。当比较和评估这三种方法时，以下的因素都被考虑：鉴定分离株的能力、用其他方法确证数据、成本、易用性、网络资源/指令、和数据库/计算机软件。 

鉴定分离株的能力和用其他方法确证鉴定
    由于使用未知的环境分离株其鉴定的准确性难以确保，我们在鉴定方法之间通过他们鉴定分离菌株的能力以及鉴定的证据来评估我们的所使用的方法。在API与Accugenix方法之间进行数据的比较，得出了一个高水平的差异（74%）。总的来说，这两种方法在鉴定分离株（API的74％；Accugenix 70％）方面可以相媲美，，但用来识别革兰氏阴性VS革兰氏阳性分离株时，存在性能上的差异。API能够鉴定更多的革兰氏阴性分离株（86%）相比较Accugenix的（66%）。但是Accugenix能够鉴定更多的革兰氏阳性菌株（100%）相比较API的（33%）。

高水平的API和Accugenix鉴定之间的差异是难以解释的，但可能是因为缺乏环境分离株数据库中的收录信息部分。纯培养过程不是可能引起样品鉴定差异的原因。因为菌株一直被挑取和重新分离以保持纯度。
    API 20E和API 20NE系统鉴定86％的革兰阴性分离株相比API CHB/ E系统，只有33％的革兰氏阳性分离株被鉴定。这表明，API 20E和API 20NE系统进行鉴定环境分离株比API CHB/ E系统更好。由于API CHB/ E系统是专门设计来鉴定芽孢杆菌和相关属的，这也许可以解释一些差异和低识别率观察。

API 20NE、API 20E和Microgen比较表明Microgen可能是一个更可靠的系统。Microgen鉴定了所有分离菌株（100％）与API的20NE和20E联合使用鉴定了（90％）相比。此外，71％的API 20E和API 20NE相结合的菌株鉴定数据被Microgen鉴定所证实。Microgen高的鉴定百分率可以归因于Microgen的编号系统提供一个更广泛的数据库。虽然API 20E和20NE系统的设计，主要用于临床和食品分离株使用，Microgen的数据库中声称，结合临床，食品，环境和兽医数据。不完整的数据库，也可考虑为差异的一个部分。例如，鞘脂杆菌属 spiritivorum和苍白杆菌属 anthropi不是Microgen的数据库中的一部分，和放线菌属，不是API的数据库中的一部分。

 正如预期的那样，我们的数据表明，API 20NE比API 20E能更好地适应鉴定环境分离株。Toti等人（1996年）和Israil等人（2003）也指出，针对环境样品的分析，API的20NE系统比API20E系统提供了一个更高分辨率的正确鉴定。API系统的限制是一个不争的事实
，革兰阴性杆菌的鉴定需要确定是否肠道或非肠道分离菌的信息支持。如果没有这些信息，环境分离株需要的API20E和API20NE系统各自的性能去鉴定。两次测试之间的鉴定差异经常出现，互相混淆，尤其是当每个测试标识出分离株的一个高百分比概率。而这个问题没有发生在Microgen系统上，因为这两个条旨在配合工作，因为这两个测试条旨在配合工作，只需其中一个条确证所需鉴定的生物体是否氧化酶阴性。 

成本分析
    估计成本，鉴定一个分离株如下：
API 20E为7.16；API 20NE为$5.66；Microgen GN-A为$3.33；Microgen GNB为$4.17；Accugenix为$ 75.00~$31500根据周转周期而定。基因测试与生化鉴定系统相比被证明是非常昂贵的，是不现实的。在有限的资源条件下。Microgen系统的研究方案是较API系统便宜的，但如果API系统可获得折扣，便可使这两个系统的成本可比。

易于使用
    试剂盒的研制，接种准备，接种程序比较表明，Microgen比API系统更容易使用。Microgen测试条相比较API的测试条，减少了它约一半的准备和接种的时间。Microgen（Microgen的一个培养温度相比较API设置的2个培养温度），培养的标准也简单。分子生物学使用方法不包括在这次比较中，因为菌株鉴定实验不是在我们的实验室进行的。

说明/ Web资源
总体而言，Microgen的说明书和网络资源比API的信息更详细，更易于使用，并提供更多的信息。 

API网络 VS Microgen识别系统
    Api网络提供物种鉴定和表型概率的索引（配置文件的字符）。它总是一个完整的生物化学检测清单，和1至4个额外的测试组成。Microgen ID软件提供在线的应用手册和连接到Microgen网站的链接。该软件提供五个最可能的鉴定选择、可能性、鉴定概率、及每一个选择的分化程度。它还提供了三个异常反应和最多五个额外的测试，以便进一步区分。最新的名称上的变化和分类的起源也包括在内。

与所有其它的鉴定方法一样，测试系统没有100％准确或可靠的。测试鉴定系统的局限性包括：不完整的计算机化的数据库，数据库的准确性，来源菌株进行测试（临床，分子食物或环境）和核酸的提取方法。

 我们的研究结果表明，生化代谢分析可以有效地用来识别特定的环境细菌分离。虽然所有三种方法细菌鉴定都是可行的方案，但是生化方法更便宜，更容易使用，提供快速的结果，不需要使用专门的设备和分子生物学方法所需的程序。这是特别重要的，尤其当试图分离和鉴定大量细菌需要在一个很短的时间内完成时。生化方法也允许我们建立一个菌株代谢概况特点的数据库。McRoy和Seidler（1973年），Siebeling等。（1975年），阿库纳等（1999）和迪亚兹等人（2006）还利用生化检测，识别与龟相关的微生物种群。

 系统测试两个生化方法中，Microgen似乎是最适合用于鉴定海龟蛋的环境分离菌株。
API和Microgen成本相媲美，但Microgen系统被证明使用是更简单的，相比API 20E和API 20NE有最高的确证鉴定比例。微生物学国际（2002）进行的一项研究也指出了类似的结果。Microgen ID系统是一个相对简单和成本效益好的用于某些生态检测的鉴定系统，非常适合面对小和/或有限的资源的大学和研究实验室。