中国工程院食品安全院士团队

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产品名称：蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
英文名称：Rapid Detection Kit for Bacilluscereus (Fluorescent Probe Assays)

产品编号与包装规格：

产品简介：本试剂盒仅适用于食品中蜡样芽孢杆菌的定性检测。

检测原理：基于 Real Time PCR 技术，利用针对于蜡样芽孢杆菌 16s rRNA、gyrB 基因设计特异性引物、荧光探针以及其他反应所需试剂，加入待检样品即可进行扩增反应。在发生扩增过程中，荧光探针与目的基因片段结合，可被 Taq酶分解并产生荧光信号，此时荧光定量PCR仪可识别该荧光信号，同时根据其强弱变化绘制出相应的实时扩增曲线，进而判定蜡样芽孢杆菌是否检出。
16s rRNA、gyrB 基因分别对应荧光报告基团 VIC、FAM。

蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）产品组分：

储存条件与保质期：-20℃避光储存，有效期为 12 个月，避免反复冻融。

灵敏度：最低检验限达到 100 CFU/Test。

所需其他材料和适用仪器：荧光定量 PCR 仪（具有能够检测 VIC、FAM 标记的荧光通道）、高速离心机、移液器、移液枪头及离心管等。

蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）使用指南：

1，样品前处理：

1) 样品增菌液模板 DNA 的制备：
   a) 参照 GB《4789.14-2014 食品微生物学检验 蜡样芽孢杆菌检验》处理食品样品，使用胰酪胨大豆多黏菌素肉汤进行增菌，增菌时间不低于 24 h。
   b) 取以上增菌液 1 mL 到 1.5 mL 规格的无菌离心管中，6000 r/min 离心 5 min，完全去除上清；
   c) 加入 30 μL 裂解液充分悬浮管底沉淀，轻弹管壁消除气泡，99℃加热 10 min。
   d) 12000 r/min 离心 15 min，上清即为待测样品 DNA，静置冰上，长时间不用应再次离心。

2) 可疑菌落模板 DNA 的制备：挑取 MYP 琼脂平板上可疑菌落，充分悬浮于预先加有 30 μL 裂解液的无菌离心管中，后按照上述步骤 c)、d)操作。

以上 2 个 DNA 纯化使用商品化的试剂盒提取 DNA 效果更佳。

2, 加样、反应

   1) 按照需求取 n 个 PCR 反应管（n=1 管阴性对照+待检测样品数+1 管阳性对照），从试剂盒中取出预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，以上每管加入20 μL预混液，待用。
   2) 向上述 n 个反应管中分别加入阴性对照、待测样品 DNA、阳性对照各 5 μL，总反应体积为 25 μL。盖紧管盖，短暂离心，立即进行 PCR 扩增反应。
   3) PCR 反应体系为 25 μL，取 VIC、FAM 检测通道，在反应阶段 2 中 60℃时收集荧光信号，具体程序如下：

    注：在反应阶段 2 中 60℃时收集荧光信号，对于多通道荧光 PCR 仪，取荧光素“VIC”、“FAM”为信号采集通道，淬灭基团选择“None”，染料校正选择“None”。

3, 结果：一般情况下，可通过软件自动设定的基线、阈值等直接读取检测结果。如需调整，可根据所使用仪器的自身情况（如噪声等）以及选取的不同荧光通道进行调整。

   1) 质量控制：阴性对照未出现明显的 S 型扩增曲线或Ct 值＞35，阳性对照出现 S 型扩增曲线且其 Ct 值＜30。若阴阳性对照不同时满足上述条件，则本次检测结果无效，应重新检测或与产品技术支持联系。

   2) 结果判读：（根据反应所得 Ct 值判读，具体见下表：）

蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）使用注意事项：
   1、实验环境条件和过程控制应参照 GB/T 27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》规定执行。
   2、使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书全文，检测过程中建议穿洁净工作服，戴一次性手套，使用的移液枪头需提前灭菌。
   3、试剂盒中试剂使用前需充分融化、混匀，短暂离心后使用，期间需尽量避免产生气泡，加样完毕后检查反应管是否盖紧，避免泄露造成污染。
   4、待检测样品基因变异可能会造成假阴性结果；待检测样品交叉污染、实验室环境污染以及试剂污染均会造成假阳性结果。
   5、不同批号的产品请勿混合使用，请在产品有效期内使用试剂盒，由于操作不当引起的误判，以及由此误判引发的其他事项，本公司概不负责。
   6、检测完毕后，根据相关规定正确处理废弃耗材以及扩增产物。

• FZ023BF2 蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 产品使用说明书