中国工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

糖尿病慢性伤口愈合：是全球糖尿病患者面临的重要临床挑战，其病理特征包括炎症失调、血管新生不足及角质形成细胞迁移受阻，导致高达34%的糖尿病患者出现难愈性溃疡。皮肤伤口愈合的复杂过程：包括炎症、增殖和重塑三个阶段。糖尿病患者的伤口愈合过程常常受损，其特征是炎症失调、血管生成减少和角质形成细胞迁移障碍。细胞外囊泡（EVs）的作用：其天然信号传递能力、低免疫原性和高生物相容性成为组织修复领域的研究热点。EVs可通过递送核酸、蛋白质等活性分子调控受体细胞的生物学功能，但其在蛋白质靶向递送中的应用仍受限于载荷效率低、稳定性差等问题。CDK1的关键作用：细胞周期依赖性激酶1（CDK1）是细胞周期进入的关键调控因子，驱动细胞分裂。在糖尿病伤口中，CDK1的表达下调，导致细胞增殖和迁移能力下降。CDK1的缺失会减少细胞增殖和脂质代谢，导致胰岛素抵抗。

加州大学的Brian P. Eliceiri教授团队于Molecular Therapy上发表了研究成果，构建了装载CDK1的sEVs（CDK1-sEVs），并评估其在伤口微环境中介导细胞增殖、上皮再生及下游信号响应的能力。结果表明，sEV递送CDK1能够选择性且短暂地刺激促进上皮再生的细胞类型增殖，并通过增强角质形成细胞增殖加速伤口愈合。

研究结果

1.CDK1-sEVs的构建与表征验证

构建了一个含N端豆蔻酰化序列的CDK1融合蛋白(myr-CDK1)，该蛋白可有效的装载到sEVs中（图1A）。

通过囊泡流式细胞术（vFC）测定了CDK1-sEVs和对照sEVs（Mock EVs）的浓度和大小分布，显示两者相似（图1B-C） 。

vFC分析显示CDK1-sEVs和Mock EVs表面表达的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）相似（图1D-G） 。

免疫印迹实验显示CDK1-sEVs中CDK1的表达增加，而Alix、CD63和CD81的水平相似，未检测到内质网蛋白Calnexin （图1E-F）。

免疫印迹实验显示CDK1的磷酸化状态在CDK1-sEVs中未受影响（图1G）。

图1 CDK1-sEVs的表征

2. CDK1-sEVs对伤口愈合的促进作用

CDK1-sEVs处理的伤口闭合速度比Mock EVs处理的伤口更快，显示出显著的修复效果（图2A） 。

H&E染色显示CDK1-sEVs处理的伤口闭合速度比Mock EVs处理的伤口更快，显示出显著的修复效果（图2B-C） 。

Ki67免疫组化染色显示CDK1-sEVs处理的伤口中增殖细胞数量增加（图2D-E） 。

CDK1-sEVs可在糖尿病伤口愈合早期阶段显著加速上皮再生与组织修复，且双次给药可进一步增强疗效（图2F-G） 。

图2 测试CDK1-sEVs 在伤口愈合受损中的活性

3. CDK1-sEVs对人角质细胞的调节

免疫荧光染色显示CDK1-sEVs处理的细胞中CDK1蛋白分布在细胞质中（图3A）。

CDK1-sEVs处理细胞24小时后，HaCaT细胞数量较对照sEVs组增加25.6% （图3B-C）。

在丝裂霉素C存在的条件下，CDK1-sEVs仍显著加速划痕闭合，无丝裂霉素C时，划痕闭合速度更快，提示其直接促进细胞增殖及迁移的作用（图3C-D）。

流式细胞术分析显示CDK1-sEVs处理的细胞进入G2/M期的比例增加，表明其通过驱动细胞周期进程发挥功能（图3E-F）。

图3体外测试CDK1-sEVs对人角质形成细胞的活性 

4. 外泌体CDK1在细胞质中的信号通路解析

与Mock-sEVs组相比，CDK1-sEVs处理后AKTSer473磷酸化水平升高约2倍（图A-B），ERKThr202/Tyr204磷酸化水平升高约7.4倍（图4C-D），而4E-BP1Thr37/46磷酸化水平升高约6倍（图4E-F）。

免疫印迹实验进一步验证了AKT、ERK和4E-BP1的磷酸化水平增加（图4G-I） 。

CDK1-sEVs对通路分子终点的磷酸化启发作者考虑CDK1递送对染色质结构的潜在影响。

图4人角质形成细胞中CDK1-sEVs处理介导的下游信号转导 

5.  CDK1-sEVs促进组蛋白磷酸化

CDK1-sEVs处理组的pHistone H3Ser10信号较对照sEVs组升高了2.8倍，表明CDK1通过ERK通路驱动染色质重塑（图5A-B）。

免疫荧光染色显示CDK1-sEVs处理的细胞中进入有丝分裂各阶段的比例变化，特别是进入后期的细胞数量增加（图5C-D）。

CDK1-sEVs能够递送具有生物化学活性的蛋白质有效载荷，这些有效载荷可加速伤口愈合，并促进细胞增殖、迁移以及细胞信号传导。组蛋白 H3 磷酸化水平的升高突出显示了这一点，而组蛋白 H3 的磷酸化促进了细胞进入分裂后期（图6）。

图5 CDK1-sEVs处理人角质形成细胞后组蛋白磷酸化分析

图6 CDK1-sEVs作用于细胞的分子机制

创新点

1．CDK1-sEVs的开发：首次通过棕榈酰化技术将CDK1装载到sEVs中，为CDK1的稳定递送提供了一种新方法。

2．机制研究：揭示了CDK1-sEVs通过激活AKT/ERK信号通路和调控组蛋白H3磷酸化来促进细胞增殖和迁移的分子机制。

3．临床应用潜力：CDK1-sEVs在糖尿病慢性伤口愈合中的显著效果为开发新型治疗策略提供了理论依据，特别是在慢性伤口愈合领域具有重要的临床转化潜力。

来源：微生物安全与健康网，作者~牛沁雅。