用于快速提取、SERS检测和灭活细菌的等离子微针阵列贴片
发布时间：2024-09-02 浏览次数：137
摘要：食品微生物污染是世界范围内的一个重要公共卫生问题，因此迫切需要针对食源性微生物快速、高效和安全的检测策略。在这项工作中，开发了一种等离子微针(MN)阵列贴片，用于快速提取和表面增强拉曼光谱(SERS)检测大肠杆菌。首先，在微模具中交联[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)、丙烯酸2-羧乙酯(CAA)和甲基丙烯酸2-羟乙基酯(HEMA)制备亲水性微针贴片。然后，用臭氧处理获得的微针贴片，并用具有表面增强拉曼光谱(SERS)活性的适配体-金纳米爆米花(GNPOP)涂覆。生成的等离子体微针(MN)贴片可以在3分钟内从琼脂糖模拟物中提取大肠杆菌，并且能够进行表面增强拉曼光谱(SERS)分析，检测限为143 CFU/g。所提出的检测方法对大肠杆菌具有很强的特异性，可用于评估商业羊肉样品中的大肠杆菌污染。此外，提取的细菌可通过光热灭菌有效灭活。
等离子体微针(MN)阵列贴片检测原理图
上图中等离子体微针(MN)阵列贴片检测原理图为：首先在微模具中交联[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)、丙烯酸2-羧乙酯(CAA)和甲基丙烯酸2-羟乙基酯(HEMA)制备亲水性微针(MN)贴片。然后用臭氧处理获得的亲水性微针(MN)贴片，并用修饰有大肠杆菌适配体的金纳米爆米花(GNPOP)涂覆获得等离子微针贴片。等离子体微针(MN)阵列贴片可在琼脂模拟物中提取大肠杆菌，并进行表面增强拉曼光谱(SERS)分析。此外，在真实羊肉样品中该贴片也具有良好的应用效果。
亲水性微针(MN)阵列贴片的合成与表征
图A阐述了微针(MN)贴片主要是由2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)，丙烯酸2-羧乙酯(CAA)和甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)单体以及三乙二醇二甲基丙烯酸酯交联剂通过原位交联反应制得;图B中可以看出较高比例的甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)能够增强亲水性微针(MN)阵列贴片的机械性能，在2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMA)：丙烯酸2-羧乙酯(CAA)：甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)为1:1:3的情况下，亲水性微针(MN)阵列贴片表现出最高的机械性能;图C为亲水性微针(MN)阵列贴片在不同孵育时间的溶胀率，从图中可以得出结论，在溶胀试验中，亲水性微针(MN)贴片在浸入超纯水中5分钟内溶胀率快速增加，而在孵育5分钟后，增加逐渐减缓;图D为亲水性微针(MN)阵列贴片数字图像，图中显示了由于亲水性微针贴片的交联作用，其在溶胀试验期间仍保持良好的完整性;图E为亲水性微针(MN)的SEM图，图中显示了等离子体微针(MN)具有圆锥形状，当进行图像放大时，发现等离子体微针(MN)表面相对圆滑。
等离子体微针(MN)阵列贴片的合成和表征
图A显示为金纳米爆米花以及适配体-金纳米爆米花的SEM图像;图B通过紫外-可见光谱显示，与球形金纳米颗粒520 nm的紫外吸收峰相比，适配体-金纳米爆米花在600 nm处显示出特征吸收峰;此外，通过图C适配体-金纳米爆米花结构的红外光谱图像在1082 cm−1 和 954 cm−1振动带的拉伸特性显示，适配体已经成功修饰到了金纳米爆米花结构上;图D为等离子体微针(MN)阵列贴片和未涂层的亲水性微针(MN)阵列贴片在荧光显微镜下的图像，可以看出，所获得的微针(MN)阵列贴片具有有序阵列结构。与亲水性微针(MN)阵列贴片相比，等离子体微针(MN)阵列贴片呈现出金色光泽;图E显示了等离子体微针(MN)阵列贴片比亲水性微针(MN)阵列贴片的机械性能弱，这是由于吸附在微针(MN)表面上的适配体-金纳米爆米花削弱了机械性能;图F显示为等离子体微针(MN)阵列贴片和未涂层的亲水性微针(MN)阵列贴片的顶部在荧光显微镜下的图像;图G为等离子体微针(MN)阵列贴片的SEM图像，其说明了在微针(MN)阵列贴片上成功的吸附了适配体-金纳米爆米花结构。
琼脂糖模拟物中检测大肠杆菌的表面增强拉曼光谱(SERS)图
图A显示了在琼脂糖模拟物中检测大肠杆菌的表面增强拉曼光谱(SERS)图像，在图中715、960、1140、1270、1457和1585cm−1处的信号强度随着大肠杆菌含量的增加而显著增强，通过分析，将1270 cm−1的信号作为主要的特征峰，715、960、1140、1457和1585cm−1处的信号作为额外的参考;图B显示为以1270 cm−1的特征峰作为信号时，信号强度与大肠杆菌浓度的线性关系图。图中信号强度与菌浓度的线性方程为：Y=72.14X-86.31，线性相关系数为0.970。
图A显示为在琼脂糖模拟物中分别检测大肠杆菌，波罗的海希瓦氏菌，金黄色葡萄球菌以及对照组的表面增强拉曼光谱(SERS)图像，图中表明波罗的海希瓦氏菌，金黄色葡萄球菌的表面增强拉曼光谱与对照组相似，而大肠杆菌的表面增强拉曼光谱在1270 cm−1的特征峰值要明显高于其它三组;图B显示了以1270 cm−1特征峰值作为检测信号时，大肠杆菌的信号强度远高于波罗的海希瓦氏菌，金黄色葡萄球菌以及对照组。
在真实羊肉中对大肠杆菌的表面增强拉曼光谱(SERS)检测
图A为等离子体微针(MN)阵列贴片在羊肉中的取样图片，图中的微孔说明微针(MN)阵列贴片具有足够的机械强度插入到羊肉样品中;图B为羊肉样品在插入等离子体微针(MN)阵列贴片(下)和不插入等离子体微针(MN)阵列贴片(上)的苏木精&伊红染料的染色图，可以看出，不插入贴片的羊肉样品具有相对紧密的组织结构，而插入贴片的样品具有由微针(MN)渗透引起的显著空腔;图C显示为插入羊肉样品后等离子微针(MN)阵列贴片仍保持其完整性的SEM图像，表明其具有足够的机械强度;图D显示为在对羊肉样品中大肠杆菌进行检测时，可以观察到大肠杆菌的特征峰。
微针(MN)贴片上细菌的光热消融图
图A为红光照射期间微针(MN)阵列贴片的热成像;图B为红光照射期间微针(MN)贴片的温度变化，图中显示出了具有大量金纳米爆米花结构的微针(MN)阵列贴片具有很好的光热转换能力;图C为红光照射前后等离子微针(MN)阵列贴片上大肠杆菌的SEM图像，图中显示出红光照射后的等离子微针(MN)阵列贴片上可以观察到大肠杆菌的形态溶解和变形以及细菌碎片，表明等离子微针(MN)阵列贴片具有良好的光热消融能力。
结论：
1、 开发的等离子微针(MN)阵列贴片能够3min内快速提取大肠杆菌，这为进行后续的快速检测奠定了基础;
2、 该方法对琼脂糖模拟物中大肠杆菌的检出限为143 CFU/g，具有优越的特异性;
3、 该方法在真实羊肉样品中仍表现出对大肠杆菌良好的检测性能;
4、 在红光照射下，等离子微针(MN)阵列贴片能够消融大肠杆菌。
因此，该研究提供了一个对大肠杆菌提取、检测、消融一体化的微针阵列贴片，为微生物分析开辟了新道路，简化了前处理和检测要求，使其在现场分析中具有巨大的潜力。
参考文献：Wang Y B, Ni H J, Li H, et al. Plasmonic microneedle arrays for rapid extraction, SERS detection, and inactivation of bacteria. Chemical Engineering Journal, 442. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.136140.
来源：微生物安全与健康网，作者~曹璐璐
