副溶血性弧菌毒力的多重qPCR检测方案
发布时间：2024-09-03 浏览次数：101
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种嗜盐的革兰氏阴性菌，广泛分布于世界各地的沿海/海洋水域，被认为是鱼类消费中最常见的食物中毒剂。因而，在水产品中监测致病性Vp的存在及水平至关重要。基于此，本研究建立了一种多重实时荧光定量PCR(qPCR)，用于水和食品中的致病性Vp的检测(tdh/trh1/trh2)，其结果与ISO 21872-1：2007进行比较显示：tdh/trh1/trh2的检测限分别为6 CFU/25 g;11 CFU/25g;8 CFU/25 g，且相较于ISO标准方法所需的3天时间(至少)，本研究耗时大大缩短，仅需24 h。
弧菌属的致病性物种是一个相当大的人类公共卫生威胁，霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌是其中最重要的病原体。其中，Vp是一种嗜盐的革兰氏阴性菌，在20世纪50年代首次被描述，广泛分布于世界各地的沿海/海洋水域，常从海产品中分离出来：鱼类、甲壳类和软体类，并被认为是鱼类消费中最常见的食物中毒剂。尽管环境和食品样本中存在副溶血性弧菌，但致病菌株存在率却很低，仅占总种群的0.3-3%。不过，检测致病菌株的重要性正在逐年增长。然而，传统的Vp 致病性鉴定是通过KP实验实现的，这种致力于检测TDH毒株，不能检测TRH毒株，不利于食品安全控制和风险评估。基于PCR的分子检测方法可以较为轻易地实现毒株的鉴定，其中，qPCR额外引入一个特异性荧光探针(针对引物位点内部的基因特异性序列)，提供了更高程度的特异性。基于此，本研究建立了一种多重qPCR方案，该方法可以实现致病性Vp(tdh和trh)的快速检测。在一次qPCR反应中，通过使用两组不同的探针即可检测tdh、trh1、trh2，这是少数几个在单一反应中检测不同形式的trh基因的致病性Vp的研究之一，以往的研究只集中在物种水平上的鉴定。
文章的工作内容可以概括为：1)比较细菌培养基质;2)比较DNA提取方法;3)建立多重qPCR检测方法并与ISO标准比较。在评估多重qPCR反应体系时，作者引入了一个内部控制对照以评估样品基质对PCR反应的抑制性，并利用模拟样本和天然样本评估了方法的灵敏度，检测限。总的来说，所开发的qPCR方法不仅达到了传统微生物方法相同的检测限，达到了相同的灵敏度(94%)，具有高特异性(100%)，而且明显缩短了反应时间(24 h)。检测时间短是至关重要的，因为一些易被细菌污染的产品是新鲜食用的，并不能长时间储存。不过，研究也有其不足之处，并未将Vp种水平检测纳入其中。
原文DOI：10.1016/j.foodcont.2011.09.015
来源：微生物安全与健康网，作者~邹晶晶
