血清里有什么东西让你复现不了实验结果？

报告显示：不要说有80%的旁友复现不了别人的实验了，甚至有60%的旁友连自己的实验结果都复现不了（狗头.doge）。

确实，确实。比如培养细胞这个环节（好短的燕国地图）。很可能换个血清牌子细胞就突然开始极化、分叉、拉丝 etc. 丝滑延毕连招。

搞来搞去都做不好，很实验室玄学时刻。

我们之前发文章就说换血清的时候要小心谨慎，大家都知道这是因为FBS成分一向不明确，也无法量化其中的活性成分，换言之其实我们也不知道具体加进去了啥营养成分。

因此，血清品牌与批次就变成了重要的玄学来源。

但，我们不可能只是继承实验室祖传规定，科学精神在于探索发问：那么，这究竟是为什么？血清里到底是什么导致了细胞的异常？

2023年，有个国内团队在Nature发了一篇报告，纯测评无水无广，他们研究了来自南美、澳大利亚和新西兰3个主流产地的8个主流FBS品牌，用来培养上皮细胞，分析血清对炎症因子基础表达的影响。

结果发现，嗯……感觉没错，血清和血清之间确实亦有差别！主要体现在IL-8的基础分泌水平上。

图：受测血清一览表

接下来，让我们来速通一下。

1 做了哪些实验？

a FBS中的小分子通过激活pERK通路，促进IL-8的表达

团队应该是打从一开始就怀疑不同的血清会扰动炎症因子的表达水平，所以就直入主题了。首先经过检测，结果如上图显示：

• 4S、5A、6N和8N FBS显著诱导HCT-8细胞分泌IL-8（图1A，那4个一柱擎天的），但未引起TNFα和IL-1β的分泌（图1B、C），我们把这四个称为IL-8 应激组。

• 但是另外四组1S、2A、3S和7A FBS对IL-8、TNFα和IL-1β的分泌均无影响。这一结果与HT-29细胞的实验结果一致（图1D、E、F），这四个在后面叫IL-8 无反应组。

所以，在IL-8应激组的 FBS中确实存在某些特定成分，可诱导上皮细胞促进IL-8的表达。 

接下来，我们要知道到底是哪些物质在促进上皮细胞分泌IL-8。

正如一开始所说，血清的成分非常复杂，里面到底有哪些东西大家都搞不明白，更何况在完全未知的情况下找到具体是哪种成分。

因此，为了进行研究，首先要缩小范围。

团队以分子量为分类标准，用超滤法先对FBS的组分进行分离，分为<3KD、<10KD和<30KD三组组分，然后分别研究。

结果发现：这三种组分都能显著提高IL-8 mRNA的水平（图2A），但<3KD组分的促进作用最显著，所以团队就考虑可能血清中的小分子更具有促进作用。

于是进一步分析发现，FBS中这种<3KD组分可以激活HCT-8细胞中的pERK，而对pp38和pJNK的水平没啥影响（图2B，β-actin是内参）。

有了正面论据，还要做一个反面论据：既然<3KD组分看起来可以促进pERK，那么加入pERK特异性抑制剂U0126就应该能消除这种促进的影响。

果然，U0126确实能完全消除<3KD FBS组分对IL-8 mRNA表达的诱导作用（图2C）。

所以团队得到了结论：就是这个<3KD FBS小分子组分，通过激活pERK通路，诱导HCT-8细胞中IL-8 mRNA的表达（图2D）。

b 代谢组谱的差别

在这里我要回答一个小小的问题：为什么除了IL-8，前面还检测了TNFα和IL-1β？

因为IL-8 是一种炎症因子，一般来说，如果存在抗原（如图中的LPS），就会出现TNFα诱导IL-1β，并进一步诱导IL-8这样一个过程。

也就是说，TNFα和IL-1β是IL-8的前摇。

团队当然也考虑到这一点，但发现在这里并没有外源性内毒素LPS的事（图3A），而且在最开始的实验中，IL-8 应激组的FBS并没有诱导IL-1β和TNFα的分泌。

所以团队推测，诱导IL-8分泌的不是外源性内毒素，而是其中的内源性物质。

根据第一张图的结果，团队用非靶向代谢组学方法分析了IL-8 应激组和IL-8 无反应组中所有内源性代谢物。

主成分分析显示，这两组胎牛血清确实存在显著差异，但同组内的变异程度较低（图3B）。

与IL-8无反应组相比，IL-8刺激组中有12种代谢物表达上调，19种代谢物表达下调（图3C）。具体的名单就不在这里可汗大点兵了，其中确实有上下调非常明显的成分，一眼就能看到。

为了进步啊进一步分析这些差异代谢物是哪来的，生信分析必不可少。

然后就是经典KEGG分析环节。结果显示，这些差异代谢物主要来源于氨基酸的代谢（图5）。

2 结论

结论就是，不同品牌的FBS确实会有一些不一样，这种不一致也确实能产生影响，体现在干扰炎症因子IL-8的背景表达上，而且程度不一。

IL-8是一种已被广泛研究的炎症因子，在各种生理过程中都能横插一脚。虽然这篇文章只研究了上皮细胞，但很有参考价值。

这证实了FBS中的小分子代谢物对细胞存在基础性影响，而这种影响在实际操作中往往被忽视。这也能解释为什么换一个批次或品牌的血清就可能造成细胞形态或状态的变化。

参考文献： Liu, S., Yang, W., Li, Y. et al. Fetal bovine serum, an important factor affecting the reproducibility of cell experiments. Sci Rep 13, 1942 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29060-7

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