HSF细胞的复苏、传代、冻存，一篇搞掂

1 背景介绍

HSF细胞（Human Skin Fibroblasts）指人皮肤成纤维细胞，是来源于人体皮肤组织的成纤维细胞，主要从人体皮肤（如真皮层）分离获得。HSF细胞是皮肤真皮层的关键细胞，负责合成细胞外基质、参与伤口愈合和组织稳态维持。HSF细胞广泛应用于皮肤生物学研究、创伤修复与再生医学、药物与化妆品研发和疾病模型与基因编辑基础研究、疾病机制探索、药物筛选和再生医学等领域。HSF细胞属于间充质来源的贴壁生长细胞，形态呈梭形或多角形，具有典型的成纤维细胞形态特征。

细胞形态：梭形（10×倍镜）

2 实验材料

• 耗材：T25培养瓶、15mL无菌离心管、50mL无菌离心管、巴氏吸管、冻存管。

• 试剂：DMEM（高糖）培养基、0.05%胰酶-EDTA、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（100x）、HBSS缓冲液（无钙镁）、DMSO。

• 设备：水浴锅、超净台或生物安全柜、离心机、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

3 实验步骤

3.1 细胞复苏

3.1.1.准备工作：

① 完全培养基配制：DMEM：FBS：双抗（青霉素+链霉素）=89：10：1，混匀，分装至50mL离心管中，保存于4℃。
② 提前将培养基放进37°C水浴锅中，准备好15mL离心管、巴氏吸管。

3.1.2.化冻细胞：取出细胞冻存管，迅速放进37°C水浴锅中，晃动冻存管，使之快速融化复温。

3.1.3.离心：将化冻的细胞（1mL）加到含9mL预热完全培养基的15mL离心管中，轻轻吹吸混匀后200×g离心5分钟。弃上清。

3.1.4.接种培养：加入2mL完全培养基重悬细胞后，转移至含有3mL完全培养基的T25细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2二氧化碳培养箱中培养。

3.1.5.注意事项

• 避免反复冻融：冻存管取出后需要迅速放置于37°C水浴锅解冻，一次用完。
• 刚复苏的细胞比较脆弱，需要轻轻吹打。

3.2 细胞传代

3.2.1.传代时机：细胞汇合度达80%时，建议按1:2比例传代。

3.2.2.操作步骤

① 用巴氏吸管吸掉原有培养基，用37℃预热的HBSS缓冲液轻轻洗涤2次。
② 加入2mL0.05% 胰酶-EDTA消化2分钟左右，根据细胞状态调整时间。在倒置显微镜下观察到细胞变圆、有少量细胞块脱落、间隙增大时加入两倍胰酶体积的完全培养基终止消化。
③ 用巴氏吸管将贴壁的细胞吹下来。将液体转移至15mL离心管中，200×g离心5分钟。弃上清。
④ 加入2mL完全培养基重悬细胞。准备两瓶T25细胞培养瓶，各加入4mL完全培养基。
⑤ T25细胞培养瓶各加入1mL细胞悬液。置于37°C，5% CO2二氧化碳培养箱中培养。

3.3.3.注意事项

• 要把握好胰酶消化的时间，过长会导致细胞状态不好或死亡，过短则消化不完全。
• HSF细胞具有密度依赖性，每次传代都要保证其密度，密度过低会导致细胞状态变差，出现“拉丝”的现象。
• HBSS缓冲液比PBS缓冲液更营养和更全面，更适合用于需要维持细胞活性或组织完整性的场景。
• 巴氏吸管比移液枪枪头力度小，对细胞伤害没那么大。但要注意有些巴氏吸管的液体刻度不准确。

3.3 细胞冻存

• 传代时机：细胞汇合度达80%-100%时，建议按1:2比例冻存。

• 配制冻存液：基础培养基： FBS： DMSO=5：4：1。

3.3.1.操作步骤

① 用巴氏吸管吸掉原有培养基，用37℃预热的HBSS缓冲液轻轻洗涤2次。
② 加入2mL0.05% 胰酶-EDTA消化2分钟左右，根据细胞状态调整时间，在倒置显微镜下观察到细胞变圆、有少量细胞块脱落、间隙增大时加入两倍胰酶体积的完全培养基终止消化。
③ 用巴氏吸管将贴壁的细胞吹下来。将液体转移至15mL离心管中，200×g离心5分钟。弃上清。
④ 用冻存液重悬细胞，调整浓度至5×106cells/mL左右，再分装至冻存管，标记细胞名称、代次、冻存日期及操作者信息。
⑤ 置于4°C，放置30分钟。转移至-20°C，放置2小时。保存至-80°C。若长时间不用则-80°C过夜放置后转移至液氮罐中。

3.3.2.注意事项

• 梯度降温是为了减少细胞内冰晶形成、缓解渗透压波动，并配合冻存液的作用，最终最大限度保留细胞的活性和功能。操作不当会导致复苏后细胞状态差甚至死亡。
• 降温程序可以用专用的细胞冻存盒代替，也可选择不用梯度降温的成品冻存液。

4 常见问题和解决方法

参考资料：
[1] http://www.cellresource.cn/fdetail.aspx?id=4831
[2] https://cctcc.whu.edu.cn/portal/no_center/cell_detail?id=882
[3] https://www.chemicalbook.com/SupplyInfo_2401251.htm

文章来源于网络，版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！