双歧杆菌BB-12与RAW264.7巨噬细胞共培养实验步骤及注意事项详解
发布时间：2026-05-29 浏览次数：16
双歧杆菌（Bifidobacterium）是一种广泛存在于人体消化道、阴道等环境中专性厌氧菌菌群。该菌属菌株可以作为益生菌而应用于食品、医药等方面；在分子生物学研究中，通过研究双歧杆菌与宿主细胞相互作用可探究细胞的免疫调节、代谢、抗衰老等功能影响。因此在双歧杆菌与细胞共培养实验中需兼顾细菌培养特性和细胞培养要求，下面以双歧杆菌BB-12和免疫细胞RAW264.7共培养为例介绍其实验步骤及注意事项。
双歧杆菌BB-12与RAW264.7巨噬细胞的共培养实验实验步骤
一、实验准备
实验对象：双歧杆菌BB-12菌株、RAW264.7巨噬细胞。
试剂、耗材准备：双歧杆菌专用培养基改良MRS琼脂平板（含莫匹罗星锂盐和L-半胱氨酸盐酸盐）、DMEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗（PS）、PBS缓冲液、胰酶、T25培养瓶、6孔板/24孔板、15mL离心管、1.5mL离心管、移液枪、tip头、细胞血球计数板等。
仪器：厌氧培养箱/厌氧罐、细胞培养箱、超净工作台/生物安全柜等。
二、实验步骤
1）、双歧杆菌BB-12的培养与处理
双歧杆菌BB-12活化：从-80℃取出冻存的双歧杆菌菌液接种至改良MRS琼脂平板（含莫匹罗星锂盐和L-半胱氨酸盐酸盐）上，置于37℃厌氧培养箱或者厌氧管中进行72h的厌氧培养后备用。
双歧杆菌BB-12扩大培养：取活化菌液按照1:10比例转接至新鲜的MRS培养基，同时在波长为600nm下，测定菌液吸光度(OD)并在室温下测定菌液的pH值，使细菌厌氧培养至对数生长期（OD600大概为0.6~0.8）。
菌悬液的制备和使用：取对数期的菌液，4℃、3000×g离心10min；去除上清后用无菌PBS缓冲液重悬细菌沉淀，重复2~3次。接着用麦氏比浊管或者OD值换算调整菌液浓度，最后用DMEM细胞培养基+10%胎牛血清（FBS）重悬细菌沉淀，也可进一步稀释获取不同菌浓度（CFU/mL）。
2）、RAW264.7巨噬细胞培养与处理
细胞复苏与传代：取自-80℃或液氮罐冻存的RAW264.7巨噬细胞迅速在37℃水浴锅中快速融化至剩余少量冰晶，在经紫外照射的生物安全柜中用移液枪去处细胞冻存液后，用6~8mL新鲜完全培养基（DMEM+10%FBS+5%PS）重悬细胞沉淀加入T25瓶置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养24h。当细胞密度达到70%~80%时用胰酶短暂消化后，按照1:3或1:4的比例接种至新的T25培养瓶，补加足够的新鲜培养基继续培养。
将步骤1）中生长状态良好的RAW264.7巨噬细胞按照5×10⁴个/孔的量接种至24孔板，并使用完全培养基培养细胞贴壁生长并达到50%~60%融合度；
3）、双歧杆菌BB-12与RAW264.7细胞共培养
更换细胞培养基：去除步骤（2）-2）中含有抗生素的完全培养基，使用无菌PBS轻轻清洗细胞1~2次，接着更换不含抗生素的完全培养基（DMEM+10%FBS）。
按照步骤（1）获取的双歧杆菌悬液浓度按照感染复数MOI=10计算加入菌悬液的量；例如估算的双歧杆菌悬液浓度为1×10⁹CFU/mL，接种细胞数量为5×10⁴个/孔，若MOI=10则V（双歧杆菌悬液）=5×104×10/1×10⁹=5/104×103μL=0.5μL。
接种细菌：按照MOI=10比例向细胞培养孔中加入双歧杆菌悬液，轻轻混匀细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱培养6~24h。
检测分析：双歧杆菌BB-12与RAW264.7巨噬细胞共培养6~24h后可收集细胞培养上清通ELISA检测炎症因子，分析双歧杆菌BB-12与RAW264.7巨噬细胞相互作用。
三、注意事项
在细菌培养操作以及细胞培养过程中要保证全程无菌操作，防止杂菌污染。
双歧杆菌为厌氧菌其培养过程遵循严格厌氧环境，因此可在厌氧箱内操作细菌接种。
RAW264.7巨噬细胞培养过程中使用含有抗生素完全培养基，确保细胞状态良好无污染；而与菌悬液共培养过程中需更换不含抗生素的完全培养基，防止抗生素杀死双歧杆菌。
使用处于对数生长期的双歧杆菌，无菌PBS清洗细菌培养基过程需轻轻吹打混匀，同时防止过度离心导致细菌破裂，离心速度通常小于5000×g。
可通过预实验摸索细菌与细胞的共培养的最佳MOI比例，例如MOI=2,4,6,8,10等，通过细胞活性检测反映细胞状态，避免细菌量过多导致细胞毒性。
共培养时细胞融合度不宜过高一般为50%~60%，否则细胞生长过快易脱落影响共培养效果。
细胞共培养时间不宜过长，一般小于48h，防止细胞的自身污染。
严格遵守微生物操作安全规范，实验后废弃物需经过高温高压灭菌处理后丢弃。
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