Western Blot与流式细胞术怎么选？原理差异、优缺点与应用场景

Western Blot可以对特定蛋白进行定性和一定程度的定量，流式细胞术既可以对特定蛋白定性也可以定量，还能具体到单细胞尺度，那么它岂不是比总是玄学容易出错的WB要精确很多？

为什么我们今天实验室依然在普遍做WB？首先，抛开流式细胞仪成本不谈

1、WB vs 流式能获取的信息

WB与流式的检测原理不同，决定了它俩能从细胞获取的信息也不同。

在WB中，抗体会跟样本的所有目标分子结合，通过条带信息定性，通过条带粗细实现半定量效果。

WB无法提供单细胞水平的信息，WB所提供的是全局、总体的信息。

而流式不同，在单细胞水平和分类能力上，流式细胞术确实比WB有显著优势。

图：Beckman 

流式通过特异性抗体与荧光标记可以进行细胞的定性分析，并进一步完成样本中不同类型细胞的分类。更重要的是，由于流式是对单个细胞进行检测，我们可以得知单细胞水平的具体信息。

但也正是因为是对细胞进行测定，在分子水平上的研究就会比WB等经典分子方法逊色，因为流式需要上的是单细胞悬液，不能对胞外游离的分子进行检测，如分泌到细胞外的细胞因子。

并且，流式依赖荧光标记与抗原表位结合，无法察觉到蛋白质本身的分子量或翻译后修饰等细微变化，因此，流式并非研究的万能钥匙。

譬如蛋白质-蛋白质间相互作用的经典研究方法往往需要检测蛋白复合物，单靠流式观察只能证明某两个蛋白是否同时存在，而非是否发生结合。

2、WB vs 流式的优缺点

流式细胞术

优点：

• 单细胞水平分辨率。
• 多参数分析：通过设定多种荧光标记，一次实验就可以获得多维数据（包括但不限于物理属性、增殖与凋亡状态、特定标志物、细胞谱系等）。
• 单细胞分选：目前大多数流式细胞仪具备单细胞分选功能，可以将目的细胞从样本中单独分选出来。
• 所得数据通量高且多维、精确，便于后续统计分析。

图：Beckman 

缺点：

• 无法获知分子量信息：仅通过荧光抗体与特定表位结合，因此无法得知检测到的蛋白是否发生修饰，只能知道它存在于该细胞。
• 难以检测低表达蛋白：背景荧光和信号重叠会限制对微弱信号的检测。
• 样本制备要求高：必须获得活性好、无粘连的单细胞悬液。

Western Blot

优点：

• 可以直观看到分子量大小：因此可以看到目的蛋白是否存在剪接体、是否降解产或翻译后修饰引起的分子量变化（一些情况需特定抗体）。
• 样本适应性广：无论是细胞还是组织，只要是能裂解提蛋白的都能用。
• 技术成熟，普适性强：几乎所有生物实验室都能做，protocol与试剂盒都很成熟。

缺点：

• 全局水平，无法反映单细胞的异质性：WB的结果是整个样本的总体水平和趋势，但趋势来源于哪些细胞不知道，而流式可以清晰识别出是哪些细胞正在表达。
• 通量较低，操作复杂：WB的操作是著名的又臭又长玄学频出，应该没人喜欢做这个，吧？
• 一部分蛋白难以制备样本：由于需要制备样本溶液，一些老大难蛋白如膜蛋白、核蛋白、不溶性蛋白等比较难以制备可供检测出结果的样本，一些蛋白需要另外富集，跨膜蛋白需要避免煮。
• 无法进行活细胞分析：WB是分子实验，需要裂解细胞制备样本。

3、用WB还是流式，如何选

流式细胞术与WB并非可替代的关系，它们不同的功能与优势可以在实验中互补。

图：CST

研究策略可以是：先用流式发现有研究价值的目标细胞亚群，分选这些亚群，结合WB、qPCR等方法来验证它们的分子机制，或利用ELISA进行定量分析。

以下是我们汇总的这两个实验的应用场景对比表：