English

环凯Lac启动子自诱导培养基介绍(原理、优势及产品特点)

发布时间:2022-07-19    浏览次数:1172

目前的重组蛋白多是采用原核表达系统尤其大肠杆菌,该表达系统因其遗传背景清楚、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,因此被大规模应用于细胞因子、工具酶、蛋白药物类等重组蛋白的表达。通常,大肠杆菌表达多采用LB肉汤培养基加诱导剂IPTG诱导的方式,该方式需要在接种大肠杆菌后监测菌体密度,待OD₆₀₀=0.6左右,再加入诱导剂IPTG诱导外源蛋白表达,不管是加入IPTG的时间还是浓度都需要大量的实验来摸索以寻求最适表达条件,操作非常繁琐,而本公司的Lac自诱导型营养肉汤在接菌后,不再需要监测细胞密度和添加IPTG,直接置于合适温度下培养就行。

自诱导培养基原理

葡萄糖作为半乳糖操纵子的阻遏因子阻止细菌利用α-乳糖,而被优先代谢,促进细菌高密度生长。一旦培养基中的葡萄糖被耗尽(通常发生在对数期的后期),乳糖被ß-半乳糖苷酶转换成异乳糖(葡萄糖-1,6-半乳糖),而后者作为IPTG诱导型启动子的诱导剂,引起乳糖阻遏子从与DNA结合的位点上释放,启动重组蛋白的表达。对于DE3基因型的E.coli中,异乳糖使T7 lac启动子去阻遏,并诱导lacUV5启动子表达T7 RNA聚合酶。通常,外源蛋白在细菌中表达时常使用IPTG诱导的启动子,如lac启动子。

lac操纵子负调控

图1 lac操纵子负调控

①无乳糖时,操纵子被阻遏。lac I基因表达产生阻遏物(绿色),阻遏物结合操纵基因(operator),阻止RNA聚合酶转录lac基因。

②有乳糖时,诱导物(inducer,黑色)与阻遏物结合,改变了阻遏物的构象,使其不在与操纵基因结合,阻遏物脱离操纵基因,RNA聚合酶起始结构基因的转录,产生多顺反子mRNA,进而翻译产生β-半乳糖苷酶、透性酶和转乙酰酶。

自诱导培养基优势

自诱导方式是在E.coli菌体生长到某一特定点时蛋白表达自发开始,去了监测菌体密度(OD600)和添加IPTG这两个步骤。与传统IPTG诱导的蛋白表达过程相比,使用自动诱导培养基极大简化了流程。

自诱导培养基(lac启动子)产品及特点

本产品利用E.coli自身对培养基中碳源和能源的调控利用机制,实现外源蛋白在细菌达到饱和期后的自动诱导。

具有下列特点:

  1. 无需添加IPTG等诱导剂,节约人力物力。

  2. 免去了密切监控培养液密度的过程,尤其适合大规模筛选。

  3. 细菌生长密度远高于传统的IPTG诱导表达系统。

  4. 外源蛋白表达量远高于传统的IPTG诱导表达系统。

  5. 即开即用,操作简单。

  6. 兼容各种培养容器(如培养瓶、培养罐、深孔管、发酵罐等)

自诱导表达的培养基可提高pET系列和其它IPTG原核诱导表达系统在大肠杆菌中蛋白的表达量,无需要培养液生长密度进行监测。此外,IPTG存在一定毒性,使用了不含IPTG的自诱导培养基可以使表达的目的蛋白量大大增加。

自诱导培养基适用的载体类型

表1 可被自诱导培养基诱导表达的大肠杆菌表达载体

启动子名称

启动子类型

依赖的RNA聚合酶

代表载体

lac

大肠杆菌启动子

E.coli RNA聚合酶

pUC,pBluescript

tac

大肠杆菌启动子,trplac杂合

E.coli RNA聚合酶

pMAL,pGEX系列

trc

大肠杆菌启动子,trplac杂合,和tac区别在于-35区-10区间隔比tac多1bp

E.coli RNA聚合酶

pTrcHis

T7-lac

T7启动子

T7 RNA聚合酶

pET,pETduet

T5-lac

T5启动子

T5 RNA聚合酶

pQE(此系列也有T7启动子表达载体)

该自诱导培养基基于F. William Studier博士的技术,使用了不同代谢成分提高细胞的生长密度,并自动诱导lac启动子开始转录。