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循序渐进地细胞驯化,有效达到细胞培养的最终目标

发布时间:2022-08-17    浏览次数:385

不论是多重实验条件的测试,或是以细胞量/产物量放大为目的,对于细胞来说,通常会是环境变异的大考验,因而导致细胞数/活性/表现可能不如预期。为了把握每一次的实验,一般建议进行循序渐进的条件转换,也就是小幅度变化的条件改变,这个过程称作”细胞驯化”。举例来说,想降低培养基中血清做测试时,将原来血清 20%的比例,下降为 15%,确认细胞生长状况稳定后,再降为10%去测试观察,这就是小幅度的条件改变。

驯化状况的评估与观察建议是以 2 代细胞为区间,其中包含几个基本建议:

      1. Cell viability > 90% 维持 2 代再转换测试条件。

      2. 观察 Doubling time 随代数的变动,若以同样条件连续 2 代都不断延长,则可能需要以最初的原有条件培养,并增加该细胞所需的专一营养物。反之,若是在细胞型态上不改变的情况下,慢1-2 小时则建议以相同的培养条件再看 1 代细胞,此时若 doubling time 不再增加,则表示已初步抓到一个适合的条件。

      3. 以高于一般继代时的细胞数完成 seeding,并且每一次继代培养时都是。举例来说,实验室平常培养时,是 seeding 3-5x10^5 cells/ml,做驯化测试时则提高到 1-2x10^6 cells/ml,且以同样的细胞数继代到第 2 代。当连续 2 代 viability 都维持 90%以上,且要以相同条件继续测时,可以下降细胞数/若要再换另一条件,则仍 seeding 较高的 1-2x10^6 cells/ml。

      4. Morphology 观察上,若仅为微小的变化,而 Doubling time/Cell viability 维持良好,则观察2 代后,仍可以再进行下一阶段的条件测试。

      5. 每隔 2 代的驯化后细胞建议都进行冻存,若是已知较为敏感的细胞,则建议观察至少 3 代再做保存与下一阶段的测试。

驯化的概念,其实也可以应用在一些初步的测试上,例如细胞实验常会做血清测试,当使用不同来源的血清时,因为营养丰富度可能并非完全相同,所以细胞在测试的第 1 代时,可能会有 doublingtime 改变的状况,一般到第 2 代培养时就会接近原来的培养状态。另外,在以细胞进行的制程上,例如抗体、蛋白药生产,都会在制程规划的阶段进行驯化测试,稳定细胞的培养状况并且优化成专门产生特定产物的条件。

将在制程上直接应用,或是未来打算往制程方面发展时,在前期驯化时就会使用非动物性来源(Animal-derived component free,ADCF)的材料,因此一般细胞培养时,会用到的猪来源trypsin(胰蛋白酶) 可能就会以 ADCF 等级的 细胞解离试剂 取代(重组蛋白酵素,对细胞温和且具有与猪来源 trypsin相同效能);使用 ADCF 等级的 细胞培养冻存液将驯化好的细胞长期保存;使用 Serum-free medium (SFM)进行制程培养,每一批次产程皆稳定。