CCK-8实验常见问题与解决办法
发布时间：2023-03-17 浏览次数：288
做实验都会遇到疑惑的地方，那么CCK-8实验中常见的问题有哪些呢？有什么解决办法？下面我们一起学习CCK-8常见问题与解决办法。
Q1：CCK-8溶液对细胞的毒性大小如何？
A1：CCK-8溶液对细胞的毒性非常低，通常观察不到细胞毒性。细胞在CCK-8法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极难获得，否则不推荐把CCK-8溶液孵育过的细胞用于其它实验。
Q2：做细胞活性检测时，每孔应该接种多少个细胞？
A2：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100 μL培养基)。
Q3：在实验中OD值太高，怎么解决？
A3：a.可以缩短加入CCK-8后的培养时间。
b. 适当减少细胞的数量。
Q4：在实验中OD值太低，怎么解决？
A4：a.适当增加细胞数量。
b.延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。
Q5：培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？
A5：不会，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不会对检测造成影响。
Q6：只可以在450nm波长处测OD值吗？
A6：可以在450nm波长处测OD值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。
Q7：若是暂不检测OD值，该如何处理？
A7：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
Q8：应该每次做标准曲线吗？
A8：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
Q9：CCK-8能否检测细菌细胞？
A9：可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向100μl大肠杆菌培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
Q10：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？
A10：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
Q11：CCK-8能否对活细胞进行染色？
A11：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上。生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。
Q12：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？
A12：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。
Q13：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？
A13：可能会有以下几个原因：
①当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
②有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。
③每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔 范围内摸索条件。
Q14：如何设定空白对照？
A14：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
Q15：哪些物质会影响CCK-8的测定？
A15：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。
Q16：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CC K-8试剂？
A16：一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
Q17：必须预培养细胞吗？
A17：不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
Q18：如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？
A18：金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm，将会100%抑制。
Q19：CCK-8试剂的保存条件？
A19：在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存，分批使用建议分装保存。
Q20：CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？
A20：不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。
Q21：有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？
A21：不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。
Q22：实验之前，是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应？
A22：需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质，在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
来源：“金沙生物”公众号
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