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细胞培养又失败了?保姆级细胞培养的详细操作步骤来了!

发布时间:2023-03-21    浏览次数:250

细胞宝宝很娇贵,无菌操作最重要。那么我们如何准备无菌环境呢?

01. 操作器械灭菌>> 

  • 移液管吸头高压灭菌(或购买事先经过灭菌的移液管吸头)。

  • 70% 酒精对物品表面消毒。

02. 超净工作台或生物安全柜>> 

  • 将超净工作台窗扇关闭到合适位置,以保证空气层流。

  • 净化工作区禁止堆放杂物,干扰洁净气流流动。

  • 工作前消毒工作台面,打开紫外灯消毒。工作结束后清理消毒台面,并进行紫外消毒。

  • 具有潜在感染性的材料需在生物安全柜中处理,禁止使用超净工作台。

03. 试剂无菌>> 

所有培养基、添加剂和试剂必须无菌,防止细胞培养过程中微生物生长。如果某些试剂和添加剂未以无菌形式提供,则需要对其进行过滤除菌或高压灭菌。此外,试剂需在无菌条件下配置和使用,以确保它们始终处于无菌状态。

请记住!无菌操作贯穿细胞培养实验始终!


接下来,我们要为细胞宝宝准备合适的食物。

细胞培养前,需要先查询细胞系相关信息,以确定适合的培养基类型以及添加剂等。大多数细胞系可以使用MEM、 DMEM 培养基或RPMI等基础培养基进行培养,并要添加一定比例的胎牛血清(FBS)


细胞宝宝还需要合适的环境,才能健康长大。

细胞培养需要控制细胞所处的温度、pH、渗透压、O2和CO2。

  • pH:大部分细胞在pH 7.4左右生长良好。

  • CO2:一般需要在专用的二氧化碳培养箱中培养,设置为5% CO2。

  • 温度:大部分哺乳动物细胞培养温度为37°C。禽类细胞在38.5°C生长最佳。昆虫细胞最佳生长温度是27°C。冷血动物细胞系可在15-26°C范围内培养。

  • 细胞培养容器:大多数细胞系在专用的细胞培养瓶上生长,不需要特殊的基质等。但一些细胞,特别是原代细胞,需要在特殊的基质(如胶原蛋白)上生长,以促进细胞贴壁、分化或生长。建议查阅相关文献,详细了解您正在培养的细胞。


细胞宝宝很孤独,我们需要每天去呵护哦。

每天用显微镜观察细胞,以监测其健康状况、生长速度和融合度(单层细胞覆盖的表面积百分比)。贴壁细胞应主要附着在培养瓶底部,呈贴壁形态(取决于不同细胞系)。悬浮细胞应呈圆形形态。一般可以把细胞形态分为三种基本形态:

细胞形态

含酚红的培养基为粉红色/橙色(培养基颜色会随 CO 2 浓度发生变化)。含酚红培养基呈淡黄色表示其pH 值降低呈酸性,通常与污染或细胞不健康有关。细胞成像实验建议使用不含酚红的培养基,避免干扰图像采集。如果出现以下情况,请丢弃细胞:

  • 细胞大量脱落(贴壁细胞系)和/或看起来干瘪并呈颗粒状/深色。

  • 细胞处于停止生长状态。


细胞宝宝需要一定的生活空间,太拥挤就需要搬家啦。

一般细胞融合度达到约 80%(即80% 的培养瓶表面被单层细胞覆盖)时,即需要进行传代培养。不建议细胞过度融合(达到100%)时传代,因为这可能会影响细胞活性。

细胞传代需要注意分板比/接种密度。不同的细胞系通常需要满足特定的分板比/接种密度,务必查看所用细胞系的培养指南。生长较快的细胞可能需要高分板比(低接种密度),而生长缓慢的细胞可能需要低分板比(较高接种密度)。

如果细胞长时间无人看管(例如公共假日或周末),建议使用低于正常水平的分板比/接种密度。但是一些细胞,特别是原代细胞生长具有密度依赖性,过低的接种密度可能导致无法生长。

细胞分板比/接种密度需要通过对样品中的细胞计数确定。细胞计数一般可使用血细胞计数板。

下面我再详细说说细胞传代的方法:

01. 贴壁细胞系>> 

贴壁细胞一般需要使用胰蛋白酶等消化液,但其可能会损伤细胞,还可能会诱使某些膜蛋白暂时内化,因此设计实验时应考虑到这一点。这时,可使用其他温和消化试剂替代。以下是贴壁细胞传代的一般步骤:

贴壁细胞传代步骤

请注意:

  • PBS洗涤是为完全除去残留的胎牛血清(FBS)、钙和镁等。必要时可多次洗涤(某些细胞系贴壁牢固,需多次冲洗才能彻底去除残留 FBS),促进胰蛋白酶消化。

  • 胰蛋白酶用量以覆盖培养瓶底部为宜,轻轻转动培养瓶,确保消化液与所有细胞接触。

  • 将培养瓶放入 37 ℃ 培养箱中,更适合消化酶的消化。不同细胞消化时间不同,为避免因过度消化而严重破坏细胞,必须每隔几分钟进行一次检查。

02. 半贴壁细胞系>> 

一些细胞系介于悬浮和贴壁细胞之间,针对松散贴壁细胞,可不使用消化液,而使用移液管温柔吹打,使细胞分散。以下是半贴壁细胞传代的一般步骤:

半贴壁细胞传代步骤

03. 悬浮细胞系>> 

悬浮细胞传代难度略低于贴壁细胞,无需经消化处理。以下是悬浮细胞传代的一般步骤:

悬浮细胞传代步骤

请注意:

  • 一些悬浮细胞生长过程中可能结团,可添加 Pluronic PF68 等解离试剂使团块分散。

  • 悬浮细胞多次传代后,细胞碎片和代谢废物会不断积累,可将细胞悬液以 100 × g离心 5 - 10 分钟,弃去上清液,将细胞沉淀重悬在新鲜培养基中。

小贴士

  • 细胞传代需要注意细胞的传代次数(细胞经历的传代培养次数)。培养中应记录传代次数,细胞代次过高,可能会发生遗传漂变或其它变异,影响您的实验。

  • 低代次细胞,以及一些自己建立的特殊细胞系需要尽量多冻存几管,以防细胞污染等情况造成您实验中断。

培养细胞是个精细活,要考虑到实验的方方面面,才能得到理想状态的细胞。最后一起看看细胞冻存、复苏和细胞计数及存活测试!

01. 细胞冻存>> 

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由冰晶形成的细胞损伤。

  • 10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

  • 取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

  • 离心1000 rpm,5 min.

  • 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml.

  • 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者。

  • 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达到-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

02. 细胞复苏>> 

  • 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

  • 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀。

  • 离心,1000 rpm,5 min。

  • 弃去上层清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养。

  • 次日更换一次培养液,继续培养。

03. 细胞计数和存活测试>> 

原理:

(1) 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2) 血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目。

(3) 存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。


材料:0.4%w/v trypan blue;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。


步骤:

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。


注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml

计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

小贴士

  • 冷冻越慢越好,复苏越快越好

  • 操作人员在接触液氮罐时应戴防护面罩、防护手套,穿防护衣,防止冻存管或气体爆裂对人体造成伤害。在存放液氮罐的房间中也应装有检测气体浓度的报警装置,防止人员晕厥的现象发生。大家在做实验的时候一定要小心操作、注意安全。

  • 冻存细胞数量要足够,一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

  • 做好标记:培养瓶上应该用马克笔做好标记,写上细胞名称、代数和冻存时间。

  • 对刚复苏的细胞动作要轻柔,避免细胞破裂。

  • DMSO对大多数细胞不敏感,所以解冻之后不需要除去DMSO,解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

  • 解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清,突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良,甚至死亡。

下面这些冻存和复苏遇到的坑请注意: 

1 复苏时遇到冻存时挖的坑

实验室偶尔也会发生这样的情况:“靠,细胞要死了,赶紧冻掉,不能让细胞死在我手里。”“天呢,细胞培养液都这么黄了,赶紧冻掉。”“妈呀,细胞融合度都逼近100%了,赶紧冻掉。”“咦,细胞好像少了点,算了,就这样吧。”如果你复苏的细胞就是上面这些人所留下来的,那就要格外注意了。

细胞老化融合度过高

解决方法:所谓知己知彼才能百战不殆,在复苏前,一定要先清楚地了解这份细胞的增殖能力。如果增殖能力不高,接种时就要增加细胞接种密度并添加5%~10%的血清。如果细胞本身数量就非常少,也可以不离心,直接接种培养(加入培养基的体积>5倍的冻存细胞体积)。复苏后3天内尽量少对细胞进行操作,延迟换液时间。

2 无孔不入的微生物

做实验就像走钢丝,稍不留神就会跌进充满微生物的沼泽中不能自拔。

解决办法:冻存时,一定要拧紧冻存管的盖子,否则水浴复苏的时候,水浴锅中的水就会渗入到冻存管中去,造成细胞的污染并会使那些低免疫力的接受移植的患者产生严重的感染。

3 细胞非正常“复苏”

那是一个安静的下午,大家都在专心地做着实验,突然听到有人大叫“这是谁的细胞,一直放在外面,都化了。”原来刚才同事取细胞的时候,把整个冻存架都拿了出来,后来居然忘记再把它放回液氮罐中。而此时细胞们已经无一幸免地 “融化了”。

解决办法:马上种瓶,千万不要把这些细胞继续放回液氮罐中冻存。此时细胞内已经有大量的冰晶形成,细胞膜已经受到损伤,如果离心就会造成细胞膜完全破碎、细胞立即死亡的后果。所以切记不要离心,而应直接种瓶,也不要进行吹打,只轻轻摇晃。培养时加入10%的血清,种瓶后48h内都不要对细胞进行操作。这是一个真实的案例,后来在大家的努力下,那些增殖能力本来就旺盛的细胞还是活了下来。

备注:本办法也同样适用于那些停电后造成超低温冰箱升温(一般升温到-40℃时就要小心了)的情况。

4 拿错了细胞,养了别人家的“孩子”

电视剧里抱错孩子的狗血剧情也同样会发生在实验室中。学校的液氮罐基本上都是公用的,所以如果样本标记不详就会发生拿错的情况。

解决办法:每支冻存管上都应用冻存专用的记号笔详细标记上细胞名称、冻存时间、样本批号等信息并将这些信息详细记录在册。存放细胞时,最好规定每个人的存放位置,免得下次找细胞的时候非要把整个液氮罐翻个底朝天才找得到。复苏拿取细胞时,也应在对应的存放位置处进行查找,找到对应的细胞后应核查记录册上的信息是否与冻存管上的细胞名称、冻存时间、样本批号一致。

5 安全第一,细胞第二

凡是和液氮接触的操作,都应该注意安全。小编的同事Z就在一次打开液氮罐盖子的时候被气体冲击了眼睛,导致眼睛当场流血,不过后来经过医治已经没有什么大碍了。还有小编的同事L在前单位工作时有一次在样本保存室里突然晕倒了(估计是液氮罐漏气所致)。

解决办法:操作人员在接触液氮罐时应戴防护面罩、防护手套,穿防护衣,防止冻存管或气体爆裂对人体造成伤害。在存放液氮罐的房间中也应装有检测气体浓度的报警装置,防止人员晕厥的现象发生。大家在做实验的时候一定要小心操作、注意安全。

6 如何让冻存的组织满血复活

很多时候我们都会遇到组织复苏培养的成功率低、长势慢的情况,这到底是哪里出错了呢?

组织冻存怎么解

解决办法:
(1)组织要剪得足够小;
(2)程序降温盒不要立马放入-80℃冰箱中,应先置于4℃冰箱内15min~30min;
(3)冻存液的体积应至少是组织体积的2~3倍;
(4)组织复苏后进行培养时,应在培养基中加入5%~10%的血清。

7 复苏后,细胞不见起色就扔掉?!

复苏2~3天后,认为细胞没有明显增殖就扔掉细胞,但其实有些细胞需要复苏一周后才会发生明显的变化。

细胞复苏无起色

解决办法:如果复苏培养3天后细胞仍不见增殖,先不要着急换液。试着补加血清、细胞因子,等一周后再看细胞增殖情况再定。

8 心急冻不了好细胞

冻存时,不要将细胞放入刚刚从-80℃冰箱中取出的程序降温盒内(此时盒内的异丙醇还是冻住的)。这样会导致细胞在一开始的时候就进入低温状态,影响细胞复苏后的存活率。

解决办法:将程序降温盒提前拿至室温中,使细胞可以从室温降至-80℃。

常规的程序降温盒中是填充了异丙醇的,所以能够以每分钟一度的速度进行降温。但是异丙醇属于有毒溶剂,又容易挥发,长期使用不但会对环境造成污染也对实验人员的安全有不利影响。推荐一款新的细胞程序降温盒,不需要填充异丙醇就可以正常工作,而且很容易打开盖子,方便拿取。

转自:abcam、 中洪博元医学实验帮、解螺旋
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