高灵敏+低成本：多功能病原体检测平台
发布时间：2024-08-26 浏览次数：189
快速灵敏地检测病原菌对疾病预防和控制至关重要。具有 DNA 切割能力的 CRISPR/ Cas12a 系统有望用于病原菌诊断。然而，基于CRISPR的检测方法的灵敏度不够理想，且成本较高。在此背景下，Yanfei Qi团队发表在Analytica Chimica Acta上的文章《A programmable sensitive platform for pathogen detection based on CRISPR/Cas12a-hybridization chain reaction-poly T-Cu》报告了一种基于 CRISPR/Cas12a 系统、杂交链反应（HCR）和聚 T-铜荧光纳米探针的多功能灵敏病原体检测平台（HTCas12a）。
为了提高检测灵敏度，研究人员利用了杂交链反应（HCR）。HCR是一种在级联反应中利用两个发夹 DNA 的无酶扩增过程，是一种多功能、高效的等温扩增方法。在该平台中，使用了HCR对低浓度核酸进行扩增，产生的长链 DNA 含有可被 Cas12a/crRNA 复合物识别的 PAM 序列，从而启动 CRISPR/Cas12a 系统的顺式和反式裂解活动。通过将 HCR 与 Cas12a 结合，可以实现信号的两步放大，从而大大提高检测的灵敏度。
基于 Cas12a 的核酸检测中，常利用酶分子识别事件转化为荧光报告探针信号的变化。报告探针一般由带有荧光团和淬灭剂的 ssDNA 构建而成，需要进行复杂的修饰，因此价格昂贵。为了解决这个问题，研究人员转向了新的报告探针——聚胸腺嘧啶（T）模板铜纳米粒子（polyT-Cu NPs）因其低成本、大斯特克斯位移和稳定的光学特性，在生物分析领域引起了极大的研究兴趣。研究人员将荧光聚 T-Cu NPs 集成到了 HCR-CRISPR/Cas12a 系统中，当CRISPR/Cas12a系统的裂解启动后，裂解剩余的聚 T40 作为模板与 Cu 离子快速反应，发出强烈的荧光。整个实验成本低到每个样品不到一美元。
为了进一步拓宽 HTCRISPR-Cas12a 检测的应用范围，研究人员选择金黄色葡萄球菌作为 HTCRISPR-Cas12a 检测的验证模型。结果发现，HCR-CRISPR 检测方法在 ssDNA 和金黄色葡萄球菌检测方面具有优异的分析性能，包括高灵敏度、单核苷酸特异性、无需分离且耗时短。值得一提的是，HTCas12a 检测不需要任何仪器，是一种适用于床边检测（POCT）的模式。同时，发夹 DNA 可根据目标 DNA 的变化而改变，只需根据目标 DNA 的变化修改发夹链的碱基，即可实现脱氧核糖核酸的检测。此外，荧光强度和目标数量之间实现了良好的线性相关，目标 DNA 的检测限低至23.36 μM，金黄色葡萄球菌的检测限为 4.17 CFU/mL。
结论：本研究利用 CRISPR/Cas12a 系统、HCR 和 Poly T40 铜簇共轭物设计了一种高灵敏度的病原体检测平台。与标准诊断方法相比，该平台具有极高的灵敏度和特异性，准确率也很高。该平台具有三个显著优势： 首先，它采用两步信号放大法实现了灵敏的病原体检测。其次，它可以通过 DNA 检测和适配体直接检测各种病原体。最后，检测成本非常低，每个样本不到一美元，如此低廉的成本为在贫困和偏远地区检测病原体提供了可能。
本研究存在的不足：仍有必要进一步提高该平台的单碱基特异性；另外，该检测方法在检测双链 DNA 目标物方面需要预处理以产生单链DNA。
参考文献：
1、Haolin Sun, Xiaoyu Zhang, Hainan Ma et al. A programmable sensitive platform for pathogen detection based on CRISPR/Cas12a -hybridization chain reaction-poly T-Cu, Analytica Chimica Acta, 1317, 2024, 342888.
2、DOI: 10.1016/j.aca.2024.342888
来源：微生物安全与健康网
链接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28399
