中国工程院食品安全院士团队

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1.CCK-8原理：

试剂盒中的WST-8是CCK-8的主要成分，呈粉色。

加入细胞中后，在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色甲臜类染料（WST-8 Formazan），并释放到细胞外溶解在培养基中，生成的黄色染料的数量与活细胞的数量和细胞活力（主要是呼吸作用的强度）成正比。

用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量‍‍，颜色越深，细胞数越多，活力越强。

为什么CCK-8实验既可以称为细胞活力实验，又称为细胞毒性实验呢？‍

对细胞而言，吸光度越高，活细胞越多，呼吸作用越强，细胞活力越好；而对药物而言，吸光度越低，活细胞越少，药物对细胞的毒性就越强。

综合以上两点，所以CCK-8就有这一对比较矛盾的名字啦。‍

2.实验分组

空白对照：不做任何处理的细胞。

阴性对照：与实验组除特定给药外其他操作相同，如：转染对照质粒的细胞。‍

3.实验步骤

① 制备细胞悬液铺 96 孔板。

消化：贴壁细胞要消化充分（可以稍过一点点），这样不需要用力吹打就可以让细胞分散得很好；如果消化不完全，就要用枪用力吹打，使细胞受到机械损伤，影响实验结果。
消化后要做细胞计数，调整到合适的密度（一般是5000-10000个细胞/孔）。

铺 96 孔板：
△ 铺板时注意不时地混匀离心管/排枪加样槽中的细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下，保持细胞悬液随时都是均匀状态，尽量保证加到每个孔中的细胞数量都是一致的。
△ 96孔板周围一圈孔不加细胞，而是加满 PBS，因为周围孔在培养箱中持续培养的过程中容易蒸发，不适合铺细胞，加 PBS 可以保护被围在中间的孔。
△ 铺完板后，轻敲板底或用振荡器摇板，帮助细胞分散。

② 37℃培养箱中培养，等待细胞贴壁。

③ 加 CCK-8 试剂 10μl/well。

使用新鲜的完全培养基稀释 CCK-8（CCK-8: 培养基=1:10），完全混匀，把带测控中旧的培养基吸出，每孔加入 100ul 新配好的含 CCK-8 的培养基（保证每孔加样量一致即可，这样做可以避免直接加 10ul CCK-8 引起的加样误差）。

加液时，注意沿着孔壁慢慢加，尽量避免出现气泡（影响酶标仪读数），如果有气泡也不用着急，可能再培养之后气泡就消失了。如果拿出来测酶标仪之前还存在气泡，可以用干净的注射器扎一下气泡。

配 CCK-8 时，多配 1-2 份（看做了多少板）含 CCK-8 的培养基，加入同一块板的空孔作为调零孔（如果细胞培养时含药物，调零孔也要加药物，只是不加细胞）；如果一次测多块板，每块板都要加调零孔。

④ 继续培养数小时（具体时间可以每30min测一次酶标仪，当吸光度在0.6-1之间最好）。肉眼看到培养基变成橙色，培养时间越长，橙色越深。

⑤ 测定 450nm 处 OD 值。

培养到合适时间，上酶标仪检测 OD 值，OD 值控制在 0.2-1，1 左右较好。

建议检测时间定点。每天在同一个时间点检测，这样每两次检测时间间隔相同，有助于得到更准确的数据。‍

4.数据处理

第一步：y = OD实验组– OD调零孔。每孔的OD 减去调零孔的OD，如果所用的仪器可以自动调零，跳过这一步计算。
第二步：复孔求平均值。
第三步：将独立重复 3 次的数据导入 graphpad prizm 画图。

数据公司会计算好出给您，您只需要导入graphpad prizm 画出柱状图即可。

如果需要测定细胞的具体数量（想知道细胞每天涨了多少个），需要建一个标准曲线。

细胞计数 → 等比稀释细胞，建立 5-8 个梯度，3 复孔/梯度 → 37℃培养箱中培养 → 加 CCK-8 试剂继续培养细胞 → 测定 OD 值 → 制作标曲，x 轴为细胞数量，y 轴为 OD 值‍。

5.MTT原理

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（ Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成蓝色的 formazan 结晶。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶（蓝紫色）形成的量与细胞数成正比。‍

MTT和CCK-8的区别：

CCK-8是在MTT的基础上发展起来的代替产品，具有检测时间短，步骤简单，细胞毒性低，可重复性好等优点。

在近些年的实验中，更多使用CCK-8进行细胞活力/细胞毒性测定，只有在特定的CCK-8无法染色的实验中，才会选择MTT进行代替。

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