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对于萌新研究生，你知道PCR, qPCR, RT-PCR, RT-qPCR, qRT-PCR的区别吗？了解这些技术都能用来做什么吗？首先，这些技术都是以PCR为基础，主要区别在于是否能够对产物进行实时定量（quantity，q）以及样本是否经过反转录（reverse transcription，RT）获得。

 PCR 

PCR全称是聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。其核心原理是利用DNA双链变性和复制的特性，通过温度控制，在体外模拟DNA的天然复制过程。

✅体系组分

模板DNA：含有待扩增目标序列的DNA，可以是基因组DNA、cDNA、质粒DNA等；需保证纯度和完整性。
引物（primer）：一对人工合成的单链寡核苷酸序列，分别与目标片段两端的序列互补。
Taq DNA聚合酶：从嗜热水生菌中分离的热稳定性DNA聚合酶，催化新链DNA的合成。
脱氧核糖核苷酸（dNTPs）：包括dATP、dTTP、dCTP以及dGTP，是合成新DNA链的原料。
缓冲液：为酶促反应提供最适的化学环境，通常含Tris-HCl（维持pH）、KCl、(NH₄)₂SO₄（提供离子强度）。
镁离子（Mg2+）：Taq DNA聚合酶必需的辅助因子，作为辅酶参与反应。
无菌超纯水：补充反应体系体积，并避免其他离子杂质的干扰。

✅反应过程

1、变性：在高温（95 °C左右）下，模板DNA双链之间的氢键断裂，解离为两条单链，作为复制的模板。
2、退火：温度迅速降低至特定温度（通常为50-65°C），使一对人工合成的引物与模板DNA两条单链上特定区域通过碱基互补配对原则结合。
3、延伸：将温度调整至Taq DNA聚合酶的最适反应温度（72°C），在4种dNTP底物存在的情况下，DNA聚合酶从引物的3'-OH末端开始，以单链DNA为模板，按5'→3'方向合成互补的DNA链。

每完成一次“变性-退火-延伸”循环，目标DNA片段的数量理论上就增加一倍（即指数级扩增）。经过25-40个循环后，目标DNA片段可被扩增数百万倍。

✅主要应用：PCR主要对DNA序列进行扩增和检测，常用于基因克隆、基因型鉴定、突变检测、DNA序列鉴定等。PCR只能扩增DNA，无法直接用于RNA检测，产物能通过测序进行定性分析，但无法进行精确定量分析，并且对于低拷贝样本检测灵敏度差。

 qPCR 

qPCR全称是实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time PCR，qPCR），在PCR过程中引入荧光探针或染料，通过荧光信号变化实时检测PCR过程中目标分子拷贝数。

✅主要组分

PCR所有组分：对模板分子进行扩增；

荧光染料：一般分为非特异性染料（SYBR green）和特异性探针（TaqMan）。

（1）非特异性染料：通过嵌入双链DNA小沟后发出强荧光，成本较低。但由于会与任何双链DNA（如非特异性条带和引物二聚体）结合，因此特异性较差。

（2）特异性探针：能够与目标序列内部结合的寡核苷酸探针，两端带有报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，猝灭基团抑制报告基团荧光；PCR延伸时Taq酶会破坏探针，使得报告基团游离并发光，因此特异性极高。

✅主要应用：qPCR能够对样本进行边扩增边定量，因此能够精确计算样本中DNA拷贝数，常用于样本的定量分析。同样由于带有荧光标记，也可以用于SNP检测和溶解曲线分析（主要通过温度变化分析DNA序列差异和产物特异性）。

 RT-PCR 

RT-PCR全称是逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription PCR，RT-PCR）使利用逆转录酶将RNA（通常为mRNA）反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，主要特点是结合逆转录和PCR两种技术。

✅主要组分

逆转录组分
（1）模板RNA：为逆转录提供模板序列，通常为总RNA或者mRNA；
（2）逆转录酶：来源于逆转录病毒（如M-MLV或者AMV），能够以RNA为模板合成cDNA；
（3）引物：主要用于结合RNA后提供延伸起始位点，主要包括Oligo（dT）（与mRNA的polyA结合）、随机引物（随机结合mRNA序列）等几种类型。
（4）脱氧核糖核苷酸（dNTPs）：包括dATP、dTTP、dCTP以及dGTP，是合成新DNA链的原料。
（5）缓冲液：为酶促反应提供最适的化学环境，通常含Tris-HCl（维持pH）、KCl、(NH₄)₂SO₄（提供离子强度）。

PCR组分：与普通PCR相同。

✅主要应用：RT-PCR主要是将RNA转换为cDNA后进行分析，因此通常用于RNA扩增和测序分析，克隆基因cDNA序列，载体构建，基因表达分析等。但RT-PCR仅能进行定性分析，无法进行精确定量。

 qRT-PCR 和 RT-qPCR 

这两个术语是定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative Reverse Transcription PCR，qRT-PCR或者Reverse Transcription quantitative PCR，RT-qPCR）的不同叫法，是将RT-PCR和qPCR相结合，通过将RNA逆转录成cDNA后，再利用qPCR对cDNA进行实时荧光定量分析的方法。目前是基因表达定量分析的金标准。

✅主要组分

qRT-PCR/RT-qPCR主要组分包括RT-PCR组分和qPCR组分，可分为两步法或者一步法。

两步法：先将RNA逆转录为cDNA，然后在进行qPCR定量分析。

一步法：直接将逆转录酶和Taq DNA聚合酶置于同一反应管中，使用优化后的Buffer进行反应。注意，一步法必须使用基因特异性引物，避免出现非特异性扩增。

✅主要应用：目前qRT-PCR/RT-qPCR主要用于不同样本间RNA表达水平分析，包括mRNA，miRNA以及病毒RNA定量分析等。在进行定量分析时，必须使用内参基因，以便校正样本量误差和RNA质量差异。

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