DNA提取中各组分作用及试剂盒原理
发布时间：2025-10-17 浏览次数：39
在分子生物学发展的早期，DNA提取依赖于手工操作的有机溶剂法。这种方法虽然奠定了核酸分离的基础，但步骤繁琐、耗时且对操作人员技术和经验要求较高，提取的DNA质量和产量不稳定。如今，这一方法已被标准化、自动化的商品化试剂盒所取代。
01、传统酚-氯仿法提取DNA
传统方法的核心是利用不同化学试剂对细胞组分的差异性作用，逐步分离纯化DNA。
详细步骤与各试剂功能：
前处理与细胞裂解：
▶ 步骤：机械匀浆或消化处理样本，以破碎组织、分散细胞。
▶ 裂解缓冲液：通常含有SDS（十二烷基硫酸钠） 等去垢剂，能有效破坏细胞膜和核膜，使组蛋白从DNA上解离，并将蛋白质变性；同时含有EDTA，可整合Mg²⁺等二价金属离子，抑制DNase的活性，防止DNA降解。
蛋白酶消化：
▶ 步骤：加入蛋白酶K，55°C孵育。
▶ 作用：蛋白酶K是一种广谱、强效的丝氨酸蛋白酶，能高效降解变性的蛋白质和多肽，包括组蛋白和细胞骨架蛋白，彻底瓦解细胞结构，并消除核酸酶，释放出基因组DNA。
有机溶剂抽提：
▶ 步骤：依次加入Tris-饱和酚（pH 8.0） 和氯仿，混合离心。
▶ 酚的作用：使蛋白质进一步变性并溶于有机相。
▶ 氯仿的作用：① 作为变性蛋白的强溶剂；② 促进有机相与水相的分离（因其比重高）；③ 去除脂类物质；④ 残留的酚会溶于氯仿中，从而被除去，避免酚残留影响后续酶促反应。
▶ 原理：离心后溶液分三层：上层水相（含DNA和RNA）、中间白色蛋白层、下层有机相（含变性蛋白和脂质）。此步骤需重复直至中间层消失，以彻底去除蛋白质。
DNA沉淀与洗涤：
▶ 沉淀：向上清（水相）中加入乙酸钠（NaAc, pH 5.2） 和预冷无水乙醇。
▶ 高盐（NaAc）的作用：Na⁺离子中和DNA磷酸骨架的负电荷，削弱DNA分子间的静电斥力，使其在乙醇中更易聚合沉淀。
▶ 乙醇的作用：以氢键结合水分子，降低了介电常数，使DNA溶解度急剧下降而从溶液中析出，形成絮状或颗粒状沉淀。
▶ 洗涤：用70%乙醇洗涤沉淀。
▶ 作用：去除沉淀中残留的盐分（乙酸钠）、乙酸和微量有机溶剂，获得更纯净的DNA沉淀。70%的浓度既能有效溶解杂质，又不会导致DNA重新溶解。
DNA溶解：
▶ 步骤：晾干乙醇后，将DNA沉淀溶于TE缓冲液或ddH₂O。
▶ TE缓冲液的优势：其中的Tris-HCl维持稳定pH，EDTA继续抑制DNase活性，比水更利于DNA的长期稳定保存。
02、DNA提取试剂盒：离心柱法与磁珠法
为解决传统方法的弊端，基于固相载体吸附原理的试剂盒成为主流，主要包括离心柱法和磁珠法。
离心柱法 (Silica Column-Based Method)
▶ 原理：在高盐、低pH的结合缓冲液环境下，DNA的磷酸骨架负电荷被屏蔽，通过氢键和疏水作用力特异性地吸附在硅胶膜上；蛋白质、色素等杂质因不结合而被离心洗去；最后在低盐、中性pH的洗脱液（如水或TE）中，氢键被破坏，DNA被洗脱下来。
▶ 流程：裂解 → 结合（至离心柱）→ 离心洗涤 → 离心洗脱。
磁珠法 (Magnetic Bead-Based Method)
▶ 原理：与离心柱法化学原理相似，核心是表面包被有硅羟基或羧基基团的超顺磁性磁珠。在 chaotropic salt（如异硫氰酸胍）存在下，磁珠特异性吸附DNA；在外加磁场作用下，磁珠-DNA复合物被固定，弃去废液；经洗涤后，在洗脱缓冲液中释放DNA。
▶ 流程：裂解 → 结合（与磁珠）→ 磁吸分离洗涤 → 磁吸分离洗脱。
两种方法的比较与选择
| 特性 | 离心柱法 | 磁珠法 |
|---|---|---|
| 优点 | 成本相对较低；纯化效果好，DNA纯度高；技术成熟，应用广泛，无需特殊设备。 | 易于自动化，可整合到大型提取仪中，通量极高；操作简便，无需反复离心，减少人为误差和样本交叉污染风险；处理速度快。 |
| 缺点 | 操作步骤多，耗时；依赖离心机，不适合极高通量操作；多次换管可能增加交叉污染风险。 | 成本较高（磁珠本身及自动化设备）；手动操作需配备专用磁力架。 |
| 适用场景 | 小规模实验、常规分子实验、预算有限的实验室。 | 大规模流行病学筛查、临床检测、基因组学项目等需要高通量、自动化的场景。 |
03、补充关键点与考量因素
样本类型：不同样本（如血液、组织、植物、真菌、细菌、FFPE）的最佳提取方案和裂解条件差异巨大，需选择或优化对应的试剂盒。
DNA片段大小：传统酚氯仿法或某些试剂盒对大片度DNA（>50 kb）的提取更具优势，而常规试剂盒更适合10-30 kb的基因组DNA。
下游应用：对DNA纯度要求极高的应用（如长读长测序、转基因拷贝数分析），需选择去除杂质（如多糖、多酚、肝素）能力更强的试剂盒或方法。
无污染要求：对于古代DNA、微量DNA或PCR敏感应用，建议使用带UDG酶和dUTP体系的试剂盒，以防既往PCR产物的污染。
环保与安全：酚氯仿法使用剧毒、易挥发的有机溶剂，对操作人员和环境危害大，而试剂盒方法通常更加安全环保。
从繁琐、危险的传统方法到高效、安全的现代化试剂盒，DNA提取技术的发展极大地推动了分子生物学的进步。选择何种方法取决于通量、成本、设备、样本类型和下游应用的综合考量。
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