水凝胶的细胞粘附和迁移实验该怎么做？
发布时间：2025-11-20 浏览次数：34
引言
在生物医学领域，水凝胶凭借良好的生物相容性、亲水性和可调控的物理化学性能，已成为组织工程、伤口修复、药物递送等场景中极具潜力的生物材料。而水凝胶能否真正实现临床应用，核心取决于它与细胞之间的相互作用——毕竟，无论是构建功能性组织，还是促进损伤部位愈合，都离不开细胞在水凝胶上“定居”并“行动”的过程。这就需要通过专门的实验，精准评估细胞在水凝胶中的两种关键行为：细胞粘附与细胞迁移。今天，我们就来讲讲这两种实验该如何操作。
细胞粘附试验
细胞在材料表面或是内部能否粘附和铺展是比较重要的一个观察指标，而细胞的粘附和铺展都会造成骨架形态的改变，因此可以利用这一点来评价材料的细胞粘附性。
细胞骨架是网状纤维结构，是高度动态的，主要是由微丝，微管和中间丝所组成的。微丝主要是肌动蛋白组成的，肌动蛋白分成肌动蛋白单体（G-actin）和纤维状蛋白单体（F-actin）。微丝的组装就是G-actin变成F-actin的过程。鬼笔环肽是从毒蕈类鬼笔鹅膏中得到的有毒环状七肽，它能与聚合的微丝（F-actin）特异性地结合，因此用异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明等荧光物质标记的鬼笔环肽能够显示微丝骨架在细胞中的分布。
具体的试验过程如下：
首先制备细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴涂在固化后的水凝胶材料表面，或是与水凝胶前体溶液进行充分混合，加入到共聚焦培养皿中，使其固化成胶。然后加入培养基置于细胞培养箱内继续培养一定时间。
在培养的第3、7、14d后取出孔板或培养皿，移液器吸净孔中培养基，孔内添加PBS溶液清洗3次，以去除残留的培养基和血清，而后吸净PBS溶液，添加4％多聚甲醛溶液室温条件下固定30min。吸净孔中多聚甲醛溶液，每孔加入PBS溶液再次漂洗3次，而后吸净PBS溶液。按说明书依次添加鬼笔环肽和DAPI染液淹没样品进行染色，室温条件下锡箔纸包裹避光孵育。
染色结束后使用PBS清洗细胞2次；吸去多余水分，在荧光或共聚焦显微镜下观察。
细胞迁移试验
细胞迁移是指细胞在外部信号的驱动下，从一个特定位置迁移到另一个位置的复杂生物过程。在生物体内，这一过程在多个生理和病理学情境下发挥着关键作用，包括但不限于损伤修复、肿瘤转移、免疫细胞的迁移以及组织修复等生命活动。用于评价细胞迁移的试验主要有划痕实验和Transwell试验。
1
划痕实验
细胞划痕实验（Cell scratch assay）是通过在细胞单层上划痕并通过延时显微镜定期捕获图像，从而研究细胞迁移运动、修复能力和细胞间相互作用的实验室技术，基本原理是：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合，于细胞迁移过程中在开始和定期捕获图像，通过测量不同时间点的划痕间距并计算差值，可对细胞的迁移能力做出判断。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验（Wound healing assay）。
1.1 试验过程
①划线：先用马克笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔，保证每孔至少穿过5条线。划线的目的只是为了辅助划痕时划的更直，有利于后续拍照分析，划线会在拍照前擦去。
②铺板培养：取细胞悬浮液2mL接种于6孔培养板，每孔6w细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
③划痕：用1mL枪头比着6孔板盖子或直尺，平行和垂直于背后的横线做十字划痕，划痕经过孔中心，枪头要垂直，不能倾斜，确保划痕的深度和宽度一致。
④清洗：吸去孔内培养基，再用PBS冲洗细胞1次，除去划下的细胞碎片。
⑤拍照：擦去6孔板背后的横线划痕后再拍照。拍照时间为制作划痕后（T0）、培养6h、12h、18h、24h。在4倍镜下进行拍照，划痕居中且垂直，注意每次拍照使用相同的放大倍数和位置，保证背景一致。T0拍照后加入待测样本（注意选用无血清培养基或低血清培养基，降低细胞增殖对实验结果的影响），并设置浓度梯度，按照上面的时间点进行拍照。
⑥结果分析，使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，测量划痕宽度或计算细胞覆盖的区域量化并比较细胞迁移的速率随时间的变化。
细胞迁移率（伤口愈合率）=（初始划痕面积-T时刻划痕面积）/初始划痕面积
细胞迁移率（伤口愈合率）=（初始细胞间距离均值-T时刻细胞间距离均值）/初始细胞间距离均值
1.2 注意事项
制作划痕时应尽量保证各个划痕宽度和深度一致，但是手动用枪头制造划痕往往难以保证划痕的一致性，影响实验结果。因此可以选择culture Insert，将细胞接种于Dish中间的Insert培养。细胞长满Insert区域后用镊子移除Insert即可产生500um、1000um宽度的划痕，如图1所示。
图1 culture Insert使用示意图
如果要单纯考虑细胞迁移，可以在划痕前先用丝裂霉素（1µg/ml）处理1h，来抑制细胞的分裂。
2
Transwell试验
Transwell实验，又被称为Transwell迁移或侵袭测定，其主要目的是研究细胞在多孔膜上的运动机制。该实验常用于研究细胞对各种刺激，如生长因子、趋化因子或细胞外基质成分，引发的迁移、趋化性和侵袭行为。Transwell实验对评估细胞穿越多孔屏障进行迁移或侵袭的能力特别有益，因为多孔屏障模拟细胞在体内组织的生理条件下的移动。
Transwell试验需要用到Transwell小室，是一个可放置在孔板里的小杯子，其中杯子的底层是一张具有通透性的膜。通常，顶部室中充满细胞，而底部室则含有化学引诱剂或诱导细胞迁移的物质。多孔膜允许细胞通过膜上的微小孔从顶部室迁移到底部室。应用不同孔径和经过不同处理的膜，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
这是我自己做的一个实验的例子，如图2，用DMEM培养基稀释的密度为1×105 cells/mL HUVECs接种于Transwell培养板（8 mm孔径）上室，下室中分别加入600 μL凝胶的缓释液和600 μL高糖DMEM培养基。24 h后，滤片用甲醛固定，0.1%结晶紫染色。使用徕卡Q-Win图像分析软件对迁移细胞计数。
图2 细胞迁移实验装置示意图
本文由环凯转载自“瓴就医疗”公众号，版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！
