从原理到实操：一文搞定细胞TUNEL凋亡检测

发布时间：2025-12-25 浏览次数：104

在医学科研中，细胞凋亡检测是基础且核心的实验环节，而TUNEL法因特异性强、灵敏度高，成为多数科研人的首选。但实操中，原理模糊、试剂选错、样本出问题、结果不理想等难题，总能让科研进度卡壳。本文聚焦TUNEL法测细胞凋亡，从实验原理、试剂购买、样本准备、注意事项到常见问题解决，全流程梳理实用干货。

实验原理

TUNEL法全称是末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，核心原理很简单：细胞凋亡时，染色体DNA会发生断裂，产生大量游离的3'-羟基末端。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）能特异性识别这些缺口，将带有荧光标记或生物素标记的dUTP连接到DNA的3'-羟基末端。之后通过荧光显微镜观察荧光信号，或用免疫组化方法检测生物素标记，就能精准定位并定量凋亡细胞。

简单来说，TUNEL法就像给凋亡细胞的DNA缺口“贴标签”，通过标签的信号找到凋亡细胞。和其他检测方法相比，它能精准区分凋亡细胞与坏死细胞、正常细胞，这也是它被广泛应用的关键原因。搞懂这个原理，后续实验操作时就能更清晰地知道每一步的目的，避免盲目操作。

试剂购买：选对试剂，实验成功一半

试剂质量直接决定实验结果的可靠性，购买TUNEL相关试剂时，这几点一定要注意，帮你避开选型误区：

匹配样本类型：先明确自己的实验样本是细胞爬片、石蜡包埋组织切片还是悬浮细胞。不同样本对应的试剂有差异，比如石蜡切片需要能耐受脱蜡、复水流程的试剂，悬浮细胞则要关注试剂的细胞适配性，购买前务必核对试剂说明书的样本适用范围。

选对标记物类型：试剂主要分荧光标记（如FITC、Cy3）和生物素标记两类。荧光标记试剂操作简单，直接用荧光显微镜观察即可，适合快速检测。

关注品牌与性价比：优先选市场口碑好、品牌信誉强的试剂，这类试剂质量更稳定，售后也有保障。不用盲目追求高价试剂，结合实验预算选择性价比高的即可。同时要注意试剂的保质期和储存条件，比如很多试剂需要-20℃冷冻保存，避免购买后因储存不当失效

固定液：4%多聚甲醛（避免乙醇，易导致背景高）

透化液：0.1% Triton X-100（冰上操作，减少细胞损伤）。

样本准备：细节把控，避免实验返工

样本准备是实验的基础，不同样本的处理流程有差异，但核心都是“规范操作、避免污染”，具体流程和注意事项如下：

细胞爬片样本

① 接种：取对数生长期细胞，以每孔 4X10的3次方~2X10的4次方细胞接种于 96 孔板中或爬片上，培养至正常生长阶段。细胞数量根据不同细胞系及细胞生长情况而定，实验前细胞密度达到 70%~80%为宜；

② 固定：吸弃培养基，加4%多聚甲醛固定液，室温固定15-30分钟，全程避免样本干燥；

③ 通透：PBS洗涤3次（每次5分钟），加0.1% Triton X-100通透液，室温孵育5-10分钟，让试剂能进入细胞内；

④ 洗涤：通透后再用PBS洗涤3次，备用。

悬浮细胞样本

① 每孔 1×105~3×10的6 次方细胞接种于 6 孔板中，培养至正常生长阶段，收集：1000 rpm离心5分钟收集细胞；

② 洗涤：PBS洗涤细胞沉淀2次；

③ 固定：加4%多聚甲醛室温固定15-30分钟；

④ 通透：离心弃固定液，PBS洗涤后加0.1% Triton X-100孵育5-10分钟；

⑤ 洗涤：PBS洗涤3次备用。

关键注意点：固定时间不能过长，否则会破坏细胞形态；通透时Triton X-100的浓度和时间要精准，过高或过长会损伤细胞，过低则达不到通透效果；所有洗涤步骤要充分，避免残留试剂干扰后续实验。

实验步骤

TdT 酶连反应

a 贴壁细胞：
a.1 5X TdT 酶缓冲液（试剂 C）在使用前请用去离子水稀释至 1XTdT 酶缓冲液；
a.2 每孔用 50μL 1X TdT 酶缓冲液覆盖细胞，室温下放置 5~10 分钟；
a.3 在平衡细胞的同时，在冰上解冻 Fluorescein-dUTP Mixture（试剂 A），并且依照下表准备足量的 TdT 孵育缓冲液。采用 1X TdT 酶缓冲液代替 TdT 酶作为阴性对照组。
表 1
a.4 弃去 1X TdT 酶缓冲液，每孔加入 50μL TdT 酶孵育液，37°C 避光孵育 2 小时，弃 TdT 酶孵育液；
a.5 每孔加入 100μL 2X SSC，室温放置 15 分钟以终止反应，弃 SSC；
a.6 加入适量 1X PBS，放置在脱色摇床或轻轻晃动样品清洗 2 次，每次 5 分钟。

b 悬浮细胞：

b.1~5.b.3 同 5.a.1~5.a.3 一致；
b.4 弃去 1X TdT 酶缓冲液，每管加入 50uL TdT 酶孵育液，37℃避光孵育 2 小时，每 15 分钟时间混匀细胞一次。
b.5 1000×g 离心 10 分钟，弃去 TdT 酶孵育液，1mL 1X PBS 重悬细胞，1000×g 离心 10 分钟，用枪头吸弃上清，重复一次。
b.6 流式细胞仪上机检测（建议染色完成后立即进行流式检测）。
图 1 采用 100μM 长春碱处理 NCI-H929 细胞 24h 后，采用 BD AccuriTM C6 流式细胞仪检测

DNA 染色

a.1 用去离子水稀释 100X DAPI 荧光染料, 制备适量 1XDAPI 反应液，避光保存；

a.2 每孔加入 100μL 1X DAPI 反应液，室温、脱色摇床避光孵育 30 分钟后，弃染色反应液；

a.3 每孔加入 100μL 1X PBS 清洗 1~3 次，每次 5 分钟；

a.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入 100μL 1X PBS 保存待用

其他染色（自备）

（可选）可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色。

图像获取及分析

建议染色完成后立即置于荧光显微镜进行观测，最大激发波长为 495nm，最大发射波长为 520nm（绿色荧光）

如果条件限制，请避光 4℃湿润保存待测，但不应超过 3 天。

注意事项：规避风险，保障结果可靠

实验过程中的细节把控，直接影响结果的准确性，这些注意事项一定要记牢：

控制实验环境：保持实验室清洁，避免灰尘污染样本和试剂；TdT酶等对温度敏感，全程在冰上操作，防止酶活性丧失。

规范试剂操作：冷冻试剂需冰上缓慢解冻，避免反复冻融；严格按说明书比例配制反应液，充分混匀；加试剂时动作轻柔，避免产生气泡，气泡会影响样本与试剂的接触。

必设对照实验：阴性对照（不加TdT酶，仅加标记dUTP和缓冲液）排除非特异性信号；阳性对照（用DNaseⅠ处理样本，诱导DNA断裂）验证试剂有效性，没有对照的实验结果不可靠。

把控孵育条件：加反应液后，37℃恒温孵育60分钟左右（具体按说明书），孵育箱内放湿棉球保持湿度，避免样本干燥。

保护荧光信号：用荧光标记试剂时，孵育后需避光洗涤、观察，防止荧光淬灭，影响结果观察。

常见问题原因及解决办法：精准排查，高效解决

实验中遇到问题不用慌，这些常见问题的原因和解决办法帮你快速排查：

背景信号过高

原因可能是样本固定不充分、通透过度、TdT酶浓度过高/孵育时间过长、洗涤不充分、荧光试剂浓度过高。

解决办法：延长固定时间；降低Triton X-100浓度或缩短通透时间；按说明书调整酶浓度和孵育时间；增加洗涤次数和时间；稀释荧光试剂。

阳性信号弱或无信号

原因可能是样本凋亡细胞少、通透不足、TdT酶失活、孵育温度/时间不够、荧光信号淬灭。

解决办法：优化实验分组保证足够凋亡细胞；提高Triton X-100浓度或延长通透时间；更换新的TdT酶并规范操作；调整孵育条件；避光操作，更换未淬灭的荧光试剂。

细胞形态不完整

原因可能是固定时间过长/固定液浓度高、洗涤操作剧烈、通透过度。

解决办法：严格控制固定条件；洗涤时轻柔操作；调整通透参数。

阴性对照出现阳性信号

原因可能是误加TdT酶、试剂污染、样本本身DNA损伤。

解决办法：重新设置对照并核对试剂添加；更换新试剂；检查样本处理流程。

互动时间

以上就是TUNEL法测细胞凋亡的全流程攻略啦，希望能帮你避开实验坑。

科研路上难免遇到难题，如果你在TUNEL实验中有其他疑问，或是有独家实操技巧，欢迎在评论区分享。

你还想了解哪些科研实验攻略？也可以留言告诉我。祝大家实验顺利，论文高产！

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